線粒體疾病是線粒體基因組（mtDNA）發(fā)生基因突變所導致的一類遺傳疾病, 僅通過雌性種系傳播。通常，細胞中超過60%的線粒體DNA發(fā)生突變就會導致疾病，并且一個人的線粒體DNA突變越多，其疾病就越嚴重，線粒體疾病目前是不可治愈的。

▲圖源：網絡（侵刪）

目前核移植（NT），也稱為線粒體捐贈，作為一種預防線粒體疾病從患病母親傳給其后代的戰(zhàn)略而受到了越來越多的關注。但由于核移植中含有少量細胞質來源的mtDNA，介導受體中mtDNA異質性改變且伴有擴增，因此需要對mtDNA突變負荷進行準確定量，現(xiàn)用NGS測序方法局限性在于成本較高、耗時較長、數(shù)據(jù)處理復雜且信噪比較低。

Leber遺傳性視神經病（LHON）最常見的母系遺傳性線粒體疾病，比利時根特大學生物系專家團利用數(shù)字PCR(dPCR)平臺對LHON相關m.11778 G＞A突變位點進行檢測，并和NGS方法進行對比，探討數(shù)字PCR在mtDNA異質性定量中的適用性。研究成果發(fā)表在知名期刊《Clinical Chemistry》上。

檢測樣本信息:

為了評估dPCR在異質性評估中的適用性，共設置了3種類型的樣品：（i）具有很高突變負荷的患者樣品13個；（ii）由健康志愿者捐贈的同質野生型樣品3個；（iii）經過NT處理的樣品，由于mtDNA殘留而攜帶低突變負荷，共6個樣本。

檢測方法：

通過處理，將樣品突變負荷范圍設置在50％至0.01％，進行分析驗證。

實驗結論:

☑  在dPCR和NGS結果上觀察到的突變率具有良好的一致性。

☑與NGS相比，dPCR具有更低的背景噪聲。使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，非患者樣本中的突變等位基因沒有陽性信號，符合預期。

☑  和dPCR結果相比，在NGS結果中幾乎所有異質樣品的次要等位基因頻率都被高估，初步猜測NGS實驗流程中可能引入了錯誤序列，經過PCR擴增改變次要等位基因頻率。

☑  相較于NGS，數(shù)字PCR成本低、操作簡便、結果直觀、更適用于低頻突變檢測。

☑  數(shù)字PCR方法適合用于核移植后線粒體異質性定量檢測。

▲naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測不同mtDNA樣本二維圖（FAM-突變型，VIC-野生型）

左上：高突變負荷患者樣本；右上：野生型樣本；左下：NT后異質性樣本；右下：NTC

▲Bland-Altman PLOT評估naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測結果和NGS結果的一致性

最后，文章conclusion給出-數(shù)字PCR具有更多優(yōu)勢，適用于核移植后線粒體的異質性評估：

▲ 圖片來源：原文第8頁

期刊介紹：

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司的naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在進行核酸檢測時具有獨特的優(yōu)勢。該系統(tǒng)利用cutting-edge微流體創(chuàng)新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作為數(shù)字PCR過程的耗材。樣品通過毛細通道網格以30,000個微滴的形式進入2D芯片中。3色熒光檢測儀器，整個流程只需要2.5小時，并可進行數(shù)據(jù)的質控和結果追溯分析，獲得的數(shù)據(jù)真實可靠。

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片數(shù)字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數(shù)濃度。