與靶點蛋白的結合活性分析成為小分子藥物開發的關鍵環節之一。小分子化合物藥物與靶點的動力學參數是非常重要的表征參數，直接影響到了化合物在體內的半衰期以及所需的藥物劑量。但缺少高通量穩定有效和耐用的生物物理/生化檢測方法成為阻礙小分子藥物發現和開發的障礙之一。
 
基于生物層干涉（BLI）技術的Octet檢測平臺具有高通量、高靈敏度（神藥二甲雙胍（129Da）的檢測）【1】、對DMSO等有機溶劑不敏感等優點，已經成為小分子藥物開發過程中的中堅力量，所以最近有幾篇文章用Octet做了海量的小分子數據，陳老濕這里show一下：
   
ITC技術對樣品本量需求大，并且對緩沖液、溫度和pH值敏感，因此限制了ITC技術在篩選復雜樣品庫中的應用。SPR技術雖然已經廣泛應用于藥物結合活性的分析，但是通量低，微流控的設計使其難以應用于復雜樣品庫的篩選，芯片與化合物的非特異性問題，小分子化合物的水溶性問題，樣品和緩沖液折光率的差異導致的假陽性問題都限制了SPR技術在該領域的應用。因此，研究人員采用成本更低，通量更高，可耐受粗樣品的BLI技術檢測小分子化合物。
 
近期就有幾篇不錯的應用BLI技術開發小分子藥物的文章發表，下面就讓陳老濕給大家作一個簡單的介紹（文末有陳老濕力推的小分子檢測“神功寶典”，記得看到最后哦！）。
  
 
➤ 用Octet建立DNA結合的小分子藥物篩選方法
    俄勒岡州立大學【2】
DNA已經成為抗腫瘤藥物研究的一個重要的藥理學作用靶點。由于DNA的靈活性以及缺少像蛋白質那樣的結合位置，且小分子化合物結合后還可能導致DNA空間構象改變，使得開發新的化合物特異性結合靶標DNA具有一定的挑戰性。 首先研究人員選取了6個已經報道的與DNA結合的化合物優化和調整檢測方法，檢測結果與文獻報告結果一致，證明了BLI技術可適合地、可靠地、有效地檢測從微生物中提取的復雜組分與DNA的結合。
   
隨后研究人員篩選了＞100個從微生物中提取的與DNA的結合的化合物，并且得到了幾個結合活性較高的化合物，包括棘霉素，放線菌素等。
  ➤ 新冠肺炎抗病毒藥物篩選與驗證【3】
新冠病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）是理想的抗病毒靶點。中國醫學科學院的研究人員首先通過基于結構的虛擬篩選，篩選了15220個化合物。選擇結合最強的50個hits，通過Octet高通量的分析了這些化合物與靶點SARS-CoV-2 RdRp的結合活性。從中挑選結合活性強的化合物進行體外和細胞學實驗分析。研究人員發現Corilagin (RAI-S-37)作為SARS-CoV-2 RdRp的非核苷抑制劑，可直接與RdRp結合，在細胞外和細胞活性檢測中均能有效抑制聚合酶活性，抑制SARS-CoV-2感染的EC50值為0.13 μmol/L)。Corilagin具有良好的安全性和藥代動力學的數據，使其成為新冠肺炎潛在的治療藥物。
   
 
➤ 人參活性組分作用靶點研究【4】
人參能夠調節大腦興奮性，促進學習記憶，而人參的主要活性成分是人參皂苷，但是其在大腦中的作用靶蛋白尚未明確。南京中醫藥大學的研究人員通過親和層析篩選與人參皂苷主要成分相互作用的蛋白，鑒定出14-3-3 ζ 蛋白為人參皂苷在腦組織中的潛在靶點。通過生物層干涉技術BLI和等溫滴定量熱法ITC鑒定了20(S)- prototopanaxadiol (PPD，人參皂苷的代謝物)與14-3-3 ζ 蛋白的直接相互作用。14-3-3 ζ 蛋白-PPD復合物的共晶體結構表明，14-3-3 ζ蛋白的R56、R127和Y128殘基與部分PPD之間存在主要的相互作用，突變上述任何一個殘基都會導致PPD與14-3-3 ζ蛋白的親和力顯著降低。研究結果有助于更好的了解人參調節神經元活性的作用機制以及基于人參皂苷結構開發與14-3-3 ζ 結合的小分子化合物。
   
 
寫在最后     
作為技術支持的陳老濕來說，小分子的檢測還是要說一些丑話，小分子化合物樣品難度可比大分子大一些，因為：
 

1	分子量較小，信號水平較低，容易收到非特異性等因素干擾
2	一些小分子可溶性差，真實濃度與理論濃度可能有差別
3	親和力水平跨度大，檢測濃度范圍比較寬泛
4	可能含有各種有機溶劑，這對Octet和其傳感器沒有影響，但是可能對蛋白活性有影響
	因此如果檢測方法優化不當的話，實驗數據的重復性有時不甚理想。

 
鼓吹“儀器是萬能的”之類的大話是沒有用的，技術專家同用戶分享豐富的經驗以及找到切實有效的解決方案才是關鍵，才能讓儀器設備變得“萬能”。
 
最后陳老濕奉上 “神功寶典”一份《降低小分子篩選及動力學應用的變異性》，希望各位大俠早日神功大成，記得點擊下載哈！  
-參考文獻-
【1】Yaya Zhang, et al. Metformin interacts with AMPK through binding to c subunit. Mol Cell Biochem (2012) 368:69–76.
【2】Overacker, R.D. et al. Biolayer interferometry provides a robust method for detecting DNA binding small molecules in microbial extracts. Anal Bioanal Chem 413, 1159–1171 (2021).
【3】Li Q, et al. Corilagin inhibits SARS-CoV-2 replication bytargeting viral RNA-dependent RNA polymerase, Acta Pharmaceutica Sinica B, 2021.
【4】Feiyan Chen, et al.Identification and confirmation of 14-3-3 ζ as a novel target of ginsenosides in brain tissues,Journal of Ginseng Research,2020,1226-8453.