1.  摘要
多種基因治療(GT)產品正在開發當中，以治療此前無法治療的遺傳性疾病。這些高價值產品的年需求量根據適應癥和發病率的不同，差異可能高達7 logs。這種廣泛的生產規模范圍使GT生產平臺化極具挑戰性。此外，對于具有非常高年需求量的適應癥，傳統的貼壁技術，如填充床生物反應器和細胞工廠，不能滿足所需的生產能力。這一趨勢導致GT制造商轉向在攪拌罐生物反應器中使用懸浮細胞進行生產。
 
盡管攪拌罐生物反應器在抗體和重組蛋白生產方面有良好的過往記錄，并且有多種尺寸可供使用，但這些系統的使用也有諸多限制，包括比蛋白質工藝更低的細胞密度，比貼壁細胞培養更低的特異性產率，以及細胞培養中產生的大體積料液帶來的中游和下游瓶頸。
 
針對工藝強化和鏈接 (整合式連續工藝) 而設計的新技術可使產量比基于傳統可放大的貼壁技術提高4倍。最近，這些技術已經被應用于懸浮細胞培養，達到了與懸浮對照工藝相同的產量。這也意味著，強化和鏈接性的生物反應器可相當于2,000L或以上的攪拌罐反應器體系（STR）。本文將討論這些技術如何彌合產能差距、基因治療平臺化生產、以及減少操作占地。
 
2. 簡介
2.1  當前的市場考量
在未來的2025年，GT市場預計價值將達到120億美元。這些產品主要針對一些目前沒有治療方法的適應癥，以顯著提高患者的生活質量，甚至于可提高患者的生存機會。相較而言，單抗的年需求量(在美國)估計在數百克(如Remicade®)到數百公斤(如Rituxan®)之間，基因治療產品的需求量差異可能>7 logs。
   
例如，用于利伯氏先天性黑蒙的基于AAV的治療劑量可能為1 x 10¹¹病毒基因組(vgs)，而治療脊肌萎縮癥 (SMA) 的劑量可能為1x10¹⁴ vgs。
 
此外，杜氏肌萎縮癥(DMD)的治療預計將導致1 × 10²⁰ vgs的年需求量，這是由每個患者的高劑量和年需求量結合得出的。
 
由于GT開發商通常會試圖以不同的適應癥為目標，年度需求的顯著差異會導致GT制造商針對不同類型的應用采取不同的技術，而不是采用單一的技術，并像單抗行業那樣，根據適應癥的需求而調整規模。技術創新是否能夠在不進行重大平臺調整的情況下實現顯著的靈活性，以適應不同的目標適應癥?
 
2.2  GT制造的技術藍圖，離我們還有多遠？
傳統的病毒載體生產依賴于規模擴展的方法，以達到目標規模。這種方法使用的技術包括細胞工廠和培養瓶。與其它類型的生物制品一樣，規模擴展以獲得大量的病毒載體的方法也存在一些缺點，如產量限制、占地、人工操作數量等，導致出現占地面積、資本支出、運營成本和再現性方面的問題。
 
固定床生物反應器，歷史上曾被用于疫苗應用，已經調整用于基因治療領域，其提供了一個可規模放大的解決方案，以使用貼壁細胞生產病毒載體。然而，這種生物反應器不能提供足夠的產能。這種產能的限制促使基因治療的開發商將注意力轉向在攪拌罐生物反應器(STR)中進行的懸浮細胞培養。
 
   
STR似乎是GT制造中最靈活且可放大的傳統技術。然而，對于年需求量較高的適應癥，例如A型血友病或杜氏肌萎縮癥，即使是2,000L的STR也不夠。對于這樣的情況，產能差距只能通過使用多個系統并行地規模擴展生產來解決。Camau等人(n.d.)通過計算不同技術中劑量為1x10¹⁴vgs的產品每劑的產品成本(CoG)，說明了可放大性的好處。結果表明，多層培養瓶的每劑產品成本為~15,000USD，1,000L STR和333m²填料床生物反應器的每劑產品成本分別為~12,000 USD和~8,000USD。本研究表明，為了達到同樣的產量，STR需要更高的DNA/細胞比例 (1.5 ug/M細胞 vs 1ug/M細胞)，從而相對于填充床反應器，導致更高的CoG/劑。本文中顯示的CoG/劑比高劑量單抗產品的每劑產品成本高10至500倍。技術創新能否在縮小規模差距的同時降低病毒載體制造的制造成本?
 
3. 攪拌罐生物反應器在基因治療制造中的前景
STR有多個優點，首先這些系統的采購來源較多，并且已被很好地理解，因為它們已經被成功地應用于蛋白質和疫苗生產。此外，許多進入基因治療領域的工藝開發專業人員都有已建立的、基于懸液培養的抗體和蛋白質生產背景。懸浮培養中病毒載體生產始于細胞的擴增，以創造足夠的生物量，用于接種最終的生物反應器規模。一旦細胞在最終的生物反應器中生長至~1 × 10⁶ cells/ml (這與典型的抗體工藝相比，是相當低的數值)，進行細胞轉染步驟。細胞培養、轉染和病毒生產階段通常以批次和補料分批模式進行，也無法除培養基或進行洗脫步驟。當使用灌流時，需要細胞截留裝置，其可能對細胞健康有些害。對于細胞內產物，在工藝結束時，得在生物反應器中進行直接裂解步驟。之后，在生物反應器中進行Benzonase處理，以消解DNA。經Benzonase處理的原液隨后被澄清，以進行下游工藝(DSP)的后續階段。

  當使用1,000L 收獲體積的STR時，必須在上游和中游工藝之間的連接點處理大量含有培養基的產物，這將影響工廠設計、占地面積以及操作的方便性。對于需要多個STR并行操作的適應癥，如杜氏肌萎縮癥，這種影響將被進一步放大。
 
單抗開發商已經采用了整合式連續工藝技術，將灌流操作鏈接至多柱層析系統，以提高產量，同時降低占地面積�？紤]到HEK293細胞的剪切敏感性，使其難以接入ATF和TFF等細胞截留系統，所以，將前述工藝設計直接轉移到使用STR的GT制造中會帶來一些挑戰。這也意味著在使用STR的整個制造過程中，進行培養基置換是非常有挑戰性的步驟。
 
STR的高占地面積，加上對中間儲罐的需求以及獨立單元操作的使用，導致了非常高的操作占地面積。圖4所示為容納1,000LSTR工藝所需的占地面積。支持這一工藝所需的總占地面積是97m2。對于需要多個生產鏈并行運行的高年度需求生產，中游工藝設備可能可以跨批共享，然而，這不會顯著減少占地。技術創新能否消除GT制造中游和下游工藝操作的瓶頸?

   
4. 工藝強化和鏈接：GT制造的模式轉變 
Univercells Technologies開發了一系列下一代技術，旨在解決基因治療和疫苗生產商在需求、產品成本和工廠占地方面面臨的挑戰。這些技術應用了工藝強化和鏈接的原理，以重新定義GT制造中的可放大性。強化指的是在更小的操作占地中實現高產量，而鏈接指的是將不同的單元操作連接在一起，以實現整合的連續生物工藝。
 
工藝強化主要是通過在結構化卷式生物反應器 scale-X™中的生物質濃縮和固定來實現。通過將中游單元操作連接到NevoLine™平臺的scale-X生物反應器，強化得到了進一步的提升。NevoLine平臺能夠在最重要的步驟中降低體積 (圖3)。

4.1   scale-X生物反應器 – 基于懸浮和貼壁GT制造的兩用平臺
scale- x™生物反應器組合包括使用卷式固定床的自動化、強化生物反應器 (圖5)，其提供不同規模的配置，以促進工藝從研發到商業規模GMP生產的過渡。scale-X生物反應器由獨特的雙層結構組成，其中，親水性PET層用于細胞生長，疏水性聚丙烯網層用于培養基流動。
    
上述特點與結構化設計相結合，可實現細胞均勻分布以及營養物的高度利用，同時限制對細胞的剪切。這種設計還提高了可放大性，并增強了工藝的穩健性，因為在不同規模和生產批次之間可維持固定床壓實性。
 
Scale-X生物反應器產品系列可分為三組：hydro (研發規模)，carbo (中等規模、規模放大研究、小批量臨床和商業化生產)以及nitro (大規模臨床和商業規模生產)。在scale-X生物反應器中，細胞貼附或捕獲在纖維內，而培養基流動進、出生物反應器。
   
Scale-X生物反應器的設計已被證實可獲得相比其它基于貼壁細胞病毒生產的替代性系統顯著更高的產量，使其成為最先進的、基于貼壁細胞的病毒載體和病毒疫苗生產技術。
 
4.1.1.  Scale-X生物反應器中的貼壁細胞培養
Duyck 等 (2019)在一個簡單的概念驗證（PoC）研究中，描述了結構化固定床設計的使用，其在有限優化的前提下，使用貼壁HEK293細胞，生產基于AAV的產品，相比在細胞工廠中進行的標準工藝，接種和轉染密度降低了3倍。在此研究中，細胞生長培養基用量降低了~90%，并對洗脫步驟數進行了優化。
   
此案例研究的結果表明，在基于貼壁的GT生產中，scale-X技術有多個關鍵優勢： 

1. 使用最小的優化，即可將工藝從平面器皿轉移到可放大技術，并獲得相同的性能：這可以顯著降低工藝開發和規模放大時間線和成本。這也意味著GT開發商現在可以使用平面器皿來滿足極低年需求量的產品，如利伯氏先天性黑蒙，并很容易將這些平臺工藝轉移到可規模放大的技術，如scale-X生物反應器。
2. 可以降低接種密度：降低接種密度可以減小到達最終生物反應器的種子擴增鏈的規模，減少占地、人員需求和產品的總成本。
3. 可以降低CDAT：DNA和PEI是病毒載體制造中的一些關鍵成本驅動因素。由于這些試劑的添加與轉染時的細胞密度有關，降低轉染時的細胞密度將對產品成本產生重大影響。
4. 與傳統用于基于貼壁細胞的病毒載體生產的可放大技術相比，可以達到顯著更高的產量。與傳統填充床生物反應器相比，scale-X生物反應器的產量提高了4倍�？紤]到GT行業的產能挑戰 (圖2)，這些結果清楚地說明了下一代技術在彌補GT生物工藝產能差距方面的作用。此外，考慮到GT制造中的物料成本，用相同數量的原材料生產更多產品的能力將在降低產品成本、以克服獲得GT產品的經濟阻礙方面發揮關鍵作用。

 
4.1.2 Scale-X生物反應器中的懸浮細胞培養 
最近的一項PoC研究探索了scale-X生物反應器在懸浮細胞培養中的優勢，其使用HEK293細胞，在無血清培養基中，生產基于腺病毒的疫苗。實驗進行了3次生物反應器運行，以評估（1）固定床的細胞截留效率，（2）固定床與懸浮培養對照組中的細胞生長趨勢，以及(3)達到參考工藝70,000 vp/cell產率的能力。比較使用接種密度為5x10⁵ cells/mL的250 mL搖瓶。
 
在生物反應器運行#1的實驗中，進行了簡單的工藝轉移。在生物反應器運行#2的實驗中，生產階段的持續時間在3天后增加，以便觀察在3天的病毒生產后產量是否達到穩定狀態，就像參考工藝中的情況那樣。在生物反應器運行#3的實驗中，提高了感染時的細胞密度，以評估生物量對產量的影響。
   
本案例研究的結果證實了對于基于懸浮的GT生產，scale-X技術的多個關鍵好處：

1. 可以在結構化固定床生物反應器中截留并生長懸浮細胞。懸浮細胞被成功截留在結構化固定床生物反應器中，細胞生長階段上清液的生物量低于5%，病毒產生階段低于細胞的20%。
2. 可以快速將基于懸浮的工藝轉移至結構化固定床生物反應器：結果清楚地顯示，即使沒有對工藝進行更改(運行#1的實驗中)，也超過了70,000 vp/cell的特異性細胞產率。
3. 可以提高結構化固定床生物反應器中進行的工藝的穩健性。在41至44小時之間，不同運行的PDT相當。
4. 對于懸浮系統，結構化固定床生物反應器有可能潛在地提高特異性細胞產率：相比搖瓶對照組，所有scale-X運行都實現了更高的特異性細胞產率。在運行#3實驗的最佳情況下，scale-X中的特異性產率是搖瓶的1.7倍，這個值為結構化固定床生物反應器中基于懸浮培養的工藝優化所能實現的目標奠定了基礎。
5. 改用scale-X生物反應器可以降低培養基消耗。在實驗中，scale-X生物反應器的單位細胞培養基用量比搖瓶低12.5%。
6. Scale-X生物反應器是唯一的雙用途平臺技術，可使用懸浮和貼壁細胞進行病毒生產。目前的GT制造技術分為貼壁技術(平面器皿、固定床生物反應器)和懸浮技術(STR)。本案例研究，結合Duyck等人(2019年)的研究，第一次表明，有可能將技術與工藝脫鉤，而采用能同時實現基于貼壁和懸浮細胞的病毒生產的系統，且其可簡化跨技術的工藝轉移。

 
4.2 NevoLine平臺 – 優化上游到下游的生產線
在scale-X生物反應器中，由于細胞濃縮在固定床中，當培養基進出生物反應器時，它們仍停留在生物反應器中，避免了使用傳統細胞截留系統時，與剪切敏感性相關的挑戰。NevoLine系統可以實現灌流液澄清和濃縮(在連續或批次模式下)，從而將濃縮且澄清的原液轉移至DSP車間。
    
在NevoLine中，生產過程從在平面器皿或搖瓶中的n-2種子階段開始，然后是在平面器皿或波浪型生物反應器中進行的n-1階段。scale-X nitro生物反應器可以在低細胞密度下接種，然后在固定床中進行生物量倍增。scale-X生物反應器的最大罐體積為60L，可用于600m²的nitro。培養基循環或灌流通過固定床。在灌流模式中，在線收集并濃縮灌流液。對于裂解工藝，細胞裂解通過在生物反應器或收獲罐中使用Benzonase處理，以裂解截留在固定床中的細胞。
 
NevoLine獲得的最終產物是澄清且濃縮的物料，可直接進入DSP。工藝序列和部件可以根據客戶的特定工藝而調整。圖10所示為NevoLine中的整合式連續工藝，可以將進入DSP的體積降低到100L以下。
    
5.  GT制造技術創新的有形和無形效益
本文介紹了技術創新投資的有形和無形效益。新技術對GT制造現狀的積極影響總結如下：
 

機會	描述	影響
工藝強化	卷式固定床雙層設計可促進細胞在PET織物微環境中的截留，同時允許培養基和試劑流過網狀層而不干擾細胞；這是一個非常重要的優勢，因為它可實現灌流操作，且降低了處理體積，而不需要ATF/TFF系統，后者是額外的單元操作，是產物和細胞活性損失的潛在原因。此外，將單元操作鏈接在一起，進一步降低了處理體積。	低操作占地，降低資本支出
工藝的靈活性	將細胞（貼壁或懸�。┙亓粼诠潭ù仓械哪芰υ试S漂洗生物反應器，例如去除對細胞有毒性的殘余PEI，因此，生物反應器漂洗可以對整體產量產生積極的影響。 此外，NevoLine平臺的設計考慮了靈活性，以便通過鏈接流路配置及配方設置，實現不同的工藝設計。	簡化多產品生產
整合的連續工藝	NevoLine是一種自動化系統，可實現整合式連續工藝，無需操作員干預。	更高的產量 & 工藝穩健性
精簡的種子擴增	對貼壁細胞培養的一種批評是基于平面器皿的種子擴增操作的耗時和繁瑣性。 這可以用波浪生物反應器來克服。懸浮細胞種子擴增更簡單，而可采用固定床生物反應器。在scale-X生物反應器中，可以降低傳代數，因為生物反應器可以使用較低的細胞密度接種，最終的生物量擴增在生物反應器內發生。	占地 & 人工干預減少，降低了資本支出，同時勞動力成本降低，工藝穩健性提供
易于實現工藝平臺化的開發	本文證實，scale-X生物反應器可以簡化基于貼壁細胞和懸浮細胞的工藝轉移，以最少的運行次數，達到目標產量。	降低開發時間成本
可放大性	Scale-X生物反應器提供從2.4m2到600 m2的多種配置，以支持客戶開發旅程的不同階段。這些系統在設計上具有良好的可放大性，因為結構化的固定床確保了不同規模固定床的均勻壓實。	降低開發時間成本 更高的工藝穩健性
增強工藝性能	本文報道的結果表明，在沒有進行大量優化工作的情況下，對于貼壁和懸浮細胞培養，scale-X生物反應器的特異性細胞產率始終高于競爭技術。這為通過工藝優化，提升系統性能，設定了基礎。	更高的產能和更低的產品成本
工藝效率	USP：對于某些試劑，添加到工藝中的體積高度取決于需要處理的總體積，如用于細胞裂解的去垢劑(如Triton)以及用于DNA消解的Benzonase。當使用scale-X生物反應器時，強化的設計減少了需使用這些試劑進行處理的體積，從而減少了其用量。這點對于Benzonase這種昂貴的試劑來說尤為重要。 DSP：固定床生物反應器本身可作為一個過濾器，因此，根據工藝的不同，其可截留大部分的細胞或細胞碎片，從而使進入純化階段的料液整體上更干凈，降低過濾器的尺寸。此外，對于細胞內產物，培養基來源(外部培養基罐)和細胞的位置(scale-X生物反應器)是分離的，這意味著需要處理的整體體積可以大大減少 - 從1,000L到~100L (包括漂洗)。對于細胞外產物，當scale-X與TFF系統鏈接時，可以實現類似的效果，其可使產物在生產時被濃縮，從而降低DSP中需處理的體積，繼而降低工藝時間。	降低工藝時間、操作占地和產品成本

 
6.  技術創新賦能生物制造的下一個變革 
本文強調了GT制造面臨的一些挑戰，包括產能限制、靈活性、工藝平臺化以及產品成本。本文還顯示，使用目前市面上的技術，工藝由技術定義，例如，填充床生物反應器和細胞工廠用于貼壁細胞培養，而STR用于懸浮細胞培養。此外，跨技術的工藝轉移會導致產量的顯著下降。
 
本文的其它見解包括規模和處理體積之間的權衡，因為填充床生物反應器的處理體積和生產能力較低。而另一方面，STR可提供高達2000L的產能，但產生的大體積可能會導致中游工藝的瓶頸。此外，對于年需求量非常大的產品，即使是2000 L的STR也不能滿足產能需求。
   
技術創新為上述挑戰提供了解決方案。本文證明了新型結構化固定床生物反應器可以使工藝與技術脫鉤，即其可用于懸浮和貼壁細胞工藝。對于GT開發商來說，這提供了一個獨特的機會，可以將工藝平臺化，輕松地使其適應可放大的技術，從而加快開發進度，并降低成本。對于CDMO來說，這也提供了一個獨特的機會，可通過采用兩用技術，提高潔凈室的利用率。此外，與其它可放大技術相比，結構化固定床設計可以提高懸浮工藝和貼壁工藝的特異性細胞產率。
 
當這些結構化固定床生物反應器與整合式連續生產的自動化技術相結合時，處理體積可從1000L降低到<100 L，消除了中游工藝的瓶頸。