利用多對引物/探針分析比較qRT-PCR和ddPCR兩種方法對SARS-COV-2檢測
利用多對引物/探針分析比較qRT-PCR和ddPCR兩種方法對SARS-COV-2檢測
Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets
發表期刊：Emerging Microbes & Infections 2020 影響因子：6.9
作者單位：a State Key Laboratory of Virology, Modern Virology Research Center, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
b State Key Laboratory of Virology, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
c Department of Infectious Disease, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
d Frontier Science Center for Immunologyand Metabolism, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China
研究目的
通過使用不同的引物探針對比較qRT-PCR和ddPCR兩種檢測方法對SARS-COV-2的檢測情況。
研究背景
SARS-CoV-2的大流行對臨床病原體診斷提出了迫切的要求。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）測定法是檢驗的金標準，已被廣泛用于快速檢測SARS-CoV-2感染。但是，qRT-PCR結果不準確的問題日益暴露，qRT-PCR的假陰性報告（FNR）不可避免的，這可能會影響及時診斷，早期治療，預防傳播和評估出院標準。液滴數字PCR（ddPCR）用于SARS-CoV-2核酸檢測的補充使用可以最大程度地減少FNR。
研究人群和樣本采集
本研究中，我們使用健康人和SARS-CoV-2感染患者的鼻咽拭子cDNA，在相同條件嚴格比較了8種常用的引物/探針組的qRT-PCR和ddPCR的性能。
實驗結果
圖1A為RT-PCR檢測結果，在健康人樣本為陰性對照，其中引物對UCDC-N1、UCDC-N2、CCDC-N CT值<40表明有非特異性擴增這樣易導致10−4和10−3稀釋的低病毒載量的樣本檢測結果易出現假陽性， 相反，在沒有非特異擴增的引物探針對中， UCDC-N3，HKU-，Charité-E和HKU-ORF的檢測低載量的病毒樣本時，易出現假陰性。并且根據結果來看最靈敏的引物探針對CCDC-ORF在10−4稀釋時可以檢測到3/10（30％）陽性樣品。另外，引物探針對CCDC-ORF在病毒載量低時CT值范圍從35.5到39.4，一致性較差，在病毒載量較高時結果一致性較好表明qRT-PCR仍然是檢測正常病毒的可靠方法。
圖B表示使用相同引物/探針組的ddPCR結果，表明ddPCR在低病毒載量樣本的檢測總體上有所改善。健康樣本對照中，盡管顯示UCDC-N1和N2有擴增背景但它們仍然可以區分低病毒載量樣品（稀釋10−4）。此外，雖然UCDC-N3，HKU-N和CCDC-N顯示較低的非特異性擴增背景，Charité-E，HKU-ORF和CCDC-ORF沒有任何非特異性擴增，但是，所有低病毒載量的樣本都可以產生正確的陽性報告。因此，ddPCR可以在病毒載量較低時，可以顯著減少檢測中的FNR和FPR。
關于我們
廣州永諾生物科技有限公司成立于2010年，總部位于廣州國際生物島，是一家專注于醫學科學技術開發與服務、分子診斷產品研發與生產的高新技術企業。公司目前占地面積近6000㎡，其中碩、博士以上學歷員工占比近40%。公司依托先進的技術力量以及優秀的人才儲備，在科研服務、醫學檢測和數字PCR產品三大業務上保持領先的競爭優勢。
公司成立至今申請國家專利40多項，授權21項，計算機軟件著作權8項，廣東省高新技術產品證書8項，省、市等科技計劃項目10多項，2018年入圍了大灣區生物科技創新企業50強，獲得國家高新技術企業，廣州市科技創新小巨人企業、廣東省高新技術企業培育庫入庫企業、廣州市企業研發機構等榮譽稱號。
永諾醫療是永諾生物的全資子公司，以“中國智造”為己任，專注于數字PCR儀器與應用試劑的研發，并于2017年成功研發了國內首款擁有完全自主知識產權的MicroDrop®系列微滴式數字PCR系統并投入生產。
Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets
發表期刊：Emerging Microbes & Infections 2020 影響因子：6.9
作者單位：a State Key Laboratory of Virology, Modern Virology Research Center, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
b State Key Laboratory of Virology, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
c Department of Infectious Disease, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
d Frontier Science Center for Immunologyand Metabolism, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China
研究目的
研究背景
研究人群和樣本采集
本研究中，我們使用健康人和SARS-CoV-2感染患者的鼻咽拭子cDNA，在相同條件嚴格比較了8種常用的引物/探針組的qRT-PCR和ddPCR的性能。
實驗結果
圖B表示使用相同引物/探針組的ddPCR結果，表明ddPCR在低病毒載量樣本的檢測總體上有所改善。健康樣本對照中，盡管顯示UCDC-N1和N2有擴增背景但它們仍然可以區分低病毒載量樣品（稀釋10−4）。此外，雖然UCDC-N3，HKU-N和CCDC-N顯示較低的非特異性擴增背景，Charité-E，HKU-ORF和CCDC-ORF沒有任何非特異性擴增，但是，所有低病毒載量的樣本都可以產生正確的陽性報告。因此，ddPCR可以在病毒載量較低時，可以顯著減少檢測中的FNR和FPR。
圖1. 不同引物/探針組的qRT-PCR和ddPCR結果
- 使用不同引物/探針組進行qRT-PCR的結果。橫坐標為稀釋倍數（轉換為log10），縱坐標為Ct值， ND為陰性CT值≥40。
- 使用不同引物/探針組的ddPCR結果。橫坐標為稀釋倍數（轉換為log10）縱坐標為拷貝數。ND為陰性0拷貝。對于每個引物探針組，綠色陰影區域為健康人的樣本（IgM / IgG陰性），超出該閾值為陽性。
結果討論
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結合成像，血清測試以及經驗豐富的臨床醫生的判斷，而不是僅僅依靠qRTPCR。總之，qRT-PCR適用于大規模診斷正常病毒載量樣本中病毒感染的檢測。但是，對靈敏度和精度有特殊要求的定量ddPCR將是更理想的方法 。
文章下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/32448084/
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公司成立至今申請國家專利40多項，授權21項，計算機軟件著作權8項，廣東省高新技術產品證書8項，省、市等科技計劃項目10多項，2018年入圍了大灣區生物科技創新企業50強，獲得國家高新技術企業，廣州市科技創新小巨人企業、廣東省高新技術企業培育庫入庫企業、廣州市企業研發機構等榮譽稱號。
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數字PCR SARS-COV-2
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