完整人體器官三維重現:近紅外光片顯微鏡的應用案例

瀏覽次數：1602　發布日期：2021-4-21　

本文要點：作者介紹了一種叫SHANEL(小膠束介導的人體器官高效清除和標記)的方法來使完整的成人組織器官變得透明。同時，通過SHANEL清除與近紅外光片顯微鏡的聯用，使成像深度達到厘米級，從而進行3D組織學研究。作者在細胞分辨率上揭示了完整的人眼、人甲狀腺、人腎和轉基因豬胰腺等結構細節。

人體器官的結構和功能圖譜是各種生物醫學研究的重要內容，例如許多國家都啟動了自己的“人腦圖譜”項目。然而，這些項目在重現人體器官復雜的解剖結構上的進展都十分有限，究其原因，主要是因為缺乏在細胞水平上對人體器官進行成像的可靠技術。傳統的磁共振成像(MRI)只能為人體器官提供縱向成像，缺乏細胞分辨率。近紅外染料由于其光學特性，相比可見光染料具有成像深度深的優勢，配合全新的近紅外光片顯微鏡可以對厘米級的人體器官進行細胞和分子水平的成像，并在后期通過數據處理進行3D重現。

SHANEL是作者開發的一種通過形成小膠束，在大型哺乳動物器官中完全擴散并改善組織網，使生物組織完全透明的方法，用于進一步細胞和分子成像。作者首先實現了在1.5個月內使大小為12.0 * 7.3 * 5.0 cm的豬腦透明，清理后的豬腦大小為7.5 * 5.0 * 3.3 cm，體積縮小率為30%（圖1A-C）。作者再將SHANEL清除法應用于INS-EGFP（胰島β細胞特異性表達EGFP基因）轉基因豬胰腺（圖1D-F）。通過該方法可以很容易地評估胰島內單細胞或細胞群的胰島β細胞的三維分布，從而能夠量化胰島體積和顯示胰島的異質性（圖1G-L）。

圖1.成年豬腦和胰腺的Shanel清掃
(A)-(C) 成年豬腦和胰腺的Shanel清掃
(D)-(F) 成年豬胰腺的Shanel清掃
(G) 光片顯微鏡成像的B細胞胰島的三維分布。
(H) 中標記的區域的高倍率視圖。
(I) 中標記的標記的區域的高倍鏡視圖
(J和K) 胰島內B細胞體積的節段性三維分布。
(J)中的標記區域在(K)中以高倍率顯示。
(L) 對檢測到的小島總數進行量化，并按其體積進行分類。

在對豬腦和豬胰腺進行完整成像后，作者的下一個目標是對完整人腦進行成像。由于活體基因標記和熒光染料示蹤不適用于死后人體組織的研究，因此對人體器官的細胞和分子成像需要死后使用染料和抗體進行染色。然而，抗體標記技術在組織學中被限制在50um厚度，若先行清掃則最大成像深度為1毫米，這主要是由于組織的弱通透性和抗體在組織內擴散緩慢。作者首先建立了一個壓力驅動的泵送系統，使所有的清洗劑和細胞核標記染料通過四條動脈循環到達人腦的所有部位。作者用SHANEL清掃法對92歲女性捐贈者的完整人腦進行透明化處理（圖2A-B）。然后用IBA1(離子化鈣結合分子1)抗體標記小膠質細胞(圖2C-2J)和PI(碘化丙啶)標記細胞核。作者觀察到與白質相比，灰質中的小膠質細胞大多更大，分支更多。接下來，作者使用TH（酪氨酸羥化酶）抗體免疫標記神經元結構、用PI標記細胞核（圖2K–2N）。作者能夠在1.8*1.8*1.5cm的人腦切片上觀察到特異性標記的軸突延伸（圖2K–2N）。

圖2.光片顯微鏡拍攝的人腦組織

(A-B) SHANEL清掃處理人腦。

(C-F) IBA1（綠色）標記和PI（洋紅）標記。

小膠質細胞密度和形態的差異在整個灰質(G和H)和白質(I和J)都很明顯。

接下來，作者將SHANEL技術和光片顯微鏡進一步應用到人體腎臟的整體成像。目前腎臟捐贈者嚴重短缺，其中很大一部分患者等待腎移植，等待時間可能長達數年，移植費用可能高達50萬美元。了解人類腎臟的3D結構對于利用3D生物打印技術制造人造腎臟非常有價值。作者用SHANEL組織學方法實現了腎臟的完全透明，通過腎動脈灌注TRITC-dextran和TO-PRO3染料，標記全腎的血管和致密的細胞結構。圖中清楚顯示了主要的腎動脈、段動脈的二級分支和葉間動脈（圖3A-C）。通過光片顯微鏡，我們可以顯示大體積(1.2 * 1.2 * 0.45 cm)腎皮質內血管和腎小球的三維分布，并追蹤單個傳入小動脈及其相應的腎小球(圖3D-F)。經皮質剖面計數，皮質帶寬度約為2742±665 mm，腎小球卡尺直徑為221±37 mm，傳入小動脈直徑為71±28 mm(圖3G)。

圖3.人腎的細胞學研究

(A-C) SHANEL清掃腎臟

(D) 用光片顯微鏡對(C)所示的腎皮質區域的血管和腎小球進行三維重建。

(E-F) 高倍率光片顯微鏡(E)和共聚焦顯微鏡(F)圖像顯示了

傳入小動脈(洋紅色)和腎小球(綠色)的結構細節。

(G) 3D重建的人體腎臟解剖和皮質剖面。

為了能夠對完整的人體腎臟成像，作者使用了一臺具有平臺運動功能和大的樣品容納室(大小為25*9*7厘米)的光片顯微鏡(圖4A-E)。我們對一位93歲捐獻者的腎臟(11.*6.5*5厘米)進行了端到端掃描(圖4F-I)。在780nm自熒光通道，作者觀察到很大一部分腎皮質中的血管結構顯著減少(圖4J和4K)，這在dextran通道中也很明顯(圖4H)。切片的PAS染色，表明兩側的腎小球結構相似(圖4L)。這些數據表明，作為老年人高血壓相關變化的典型表現，血管病理可能先于腎小球病理影響到腎臟功能。通過該實驗，作者證明了SHANEL技術和近紅外光片顯微鏡的聯用可以成為研究完整人體器官病理學的新工具，為了解器官在疾病中的進展提供有價值的信息。