腫瘤免疫治療是當前癌癥研究領域的熱點之一，而對腫瘤抗原特異性T細胞的全面分析一直是該領域中一項具有挑戰性的工作。本研究中，作者通過單細胞轉錄組+TCR測序技術對腫瘤小鼠和黑色素瘤患者的血液和腫瘤組織進行分析，利用TCR序列作為“分子條形碼”的方法為鑒定循環抗腫瘤 CD8⁺ T 細胞提供新的思路。

Single-cell analyses identify circulating anti-tumor CD8 T cells and markers for their enrichment

發表時間：2021.3.2（published online）

發表期刊：Journal of Experimental Medicine ; IF=11.743

實驗平臺：10x Genomics Chromium（5’表達文庫+VDJ富集文庫）、CITE-seq

樣本類型和數量：５只皮下結腸腺癌模型小鼠和4位黑色素瘤患者，血液和腫瘤 

DOI: 10.1084/jem.20200920

研究背景 

腫瘤免疫治療徹底改變了固體和液體腫瘤的治療方式。新 CD8⁺ T 細胞從循環系統轉移到腫瘤組織，即“克隆替代”，與免疫療法更好的反應相關。但是，目前需要改進方法來鑒定針對腫瘤的T細胞，以將分析集中于少數具有預后和功能相關性的循環T細胞。

本研究中，作者使用單細胞轉錄組測序技術來跟蹤血液中與腫瘤相關的T細胞反應。使用TCR作為“分子條形碼”，使用成對的腫瘤和血液樣本來識別和表征腫瘤匹配(TM)血液CD8⁺ T細胞，這些細胞與小鼠MC38腫瘤或患者黑色素瘤中的CD8⁺ T細胞具有相同的TCR序列。對檢查點阻斷無反應患者的兩個縱向樣本中，TM細胞轉變并出現更強的功能障礙信號。研究者鑒定了富集TM細胞的候選表面標記，并在小鼠中使用CITE-seq驗證了三種標記。重要的是，與單一標記相比，這些標記基因的聯合在鑒定TM細胞上實現了更好的性能。

研究內容

1、用MC38腫瘤中匹配的CD8+ T細胞的TCR表征血液中的CD8⁺ T細胞

由于TCR編碼抗原特異性，研究者假設TCR序列可用于評估血液中哪些克隆與抗腫瘤反應相關。為了測試這一點，從小鼠配對的血液和MC38腫瘤中分離出的CD8⁺ T細胞進行了scRNAseq和TCR測序。通過對鑒定到的細胞分析發現，腫瘤中CD8⁺ T細胞多樣性高。

為了評估腫瘤和血液中的克隆重疊，用TCR序列將二者的CD8⁺ T細胞進行匹配，并進行匹配細胞（TM）與非匹配細胞（非TM）的差異基因和信號通路富集分析，結果顯示，TM細胞富集效應器信號、免疫效應過程和淋巴細胞遷移功能，非TM細胞則富集了原始CD8⁺ 細胞信號功能。使用從公開數據庫中篩選到的特征基因，發現TM細胞富集激活和TRM特征，而非TM細胞富集原始特征。總的來說，這些結果與TM細胞對腫瘤的積極反應一致，而且支持使用TCR來鑒定TM細胞而不是依賴單個標記物（如PD-１）。

Fig 1. 基于TCR序列的CD8+ T細胞scRNAseq鑒定血液中MC38 TM克隆

2、通過流式細胞術發現血液中TM CD8⁺ T細胞的轉錄特征可用于鑒定富集標記

為了測試單基因的表面marker是否可以識別TM細胞成分，研究者開發了COMET計算工具來從單細胞轉錄組結果中預測marker基因，并鑒定到了82個候選陽性標記。并通過CITE-seq驗證了CD39、CX3CR1、NKG2D三個蛋白聯合比單一標記更能提高鑒定TM細胞的敏感性和特異性。因此，除了TCR，細胞表面標記物也可被用于區分TM細胞和非TM細胞。

Fig 2. 細胞表面marker panels可以從血液中富集TM細胞

3、血液中的TM CD8⁺ T細胞比腫瘤中的匹配克隆具有更低程度的功能失調

研究者接下來檢測腫瘤中CD8⁺ T細胞（其TCR在血液中也能被檢測到，即“血液匹配”細胞）的轉錄異質性。功能分析顯示“血液匹配”細胞展現出更高水平的終末衰竭信號和TRM信號，以及更低水平的原始T細胞信號。這些發現表明，血液中的TM成分對應于腫瘤中的匹配克隆，這些克隆可能對腫瘤抗原有反應并與腫瘤殺傷相關。

接下來，研究者將血液中TM細胞的表達譜與腫瘤中的匹配克隆進行了比較并發現腫瘤內的血液匹配群體比血液中的克隆群體更具多樣性，說明CD8⁺ T細胞在進入腫瘤時發生變異并呈現出多種狀態。在群體水平和逐個克隆基礎上將TM細胞與腫瘤中“血液匹配”細胞相互比較，發現TM細胞顯著富集更多的類效應器特征而“血液匹配”細胞更富集末端耗竭特征。這些數據表明血液中的TM細胞的功能障礙比腫瘤中的匹配細胞弱，并且在遷移到腫瘤中后，這些細胞獲得了功能障礙狀態。

Fig 3. 血液中的TM CD8+ T細胞比腫瘤中相應克隆的功能障礙更低

4. 黑色素瘤患者的血液中可以檢測到活化的TM CD8⁺ T細胞

研究者對4名未接受過檢查點治療的晚期黑色素瘤患者的血液和腫瘤樣品進行了單細胞轉錄組+TCR測序，使用TCR序列作為分子條形碼來檢測血液中的TM細胞。其中每個病人的TM細胞主要存在于非原始細胞亞群中，且占比極高。另外TM細胞和非TM的表型特征都與小鼠實驗的結果一致，支持了血液中的TM細胞功能障礙可能比腫瘤中的匹配細胞弱的觀點。
 

Fig 4. TM CD8⁺ T細胞克隆可以在轉移性黑色素瘤患者的血液中檢測到，并且比腫瘤中的匹配克隆表現出更少的功能障礙跡象

5. 進行抗PD-1 治療后，患者血液縱向追蹤TM CD8⁺ T細胞并顯現出衰竭程度隨時間增加

對檢查點阻礙沒有反應的兩個病人后續得到的血液樣品進行檢測，發現兩個病人的血液和腫瘤樣品檢測到重疊的TCR。且隨著時間的推移，血液中的TM細胞可能會變得更加衰竭，但最終是腫瘤中的衰竭水平更高。

進一步的量化分析表明，TM組分相對于非TM組分的總體轉錄圖譜保持高度一致性。對病人間變異性分析發現TM或非TM組分特異的個體基因轉錄程度具有顯著相關性。若只在細胞表面marker里做這種分析也存在相關性，說明表面表達marker可被用于鑒定TM群體，它們在不同腫瘤負荷和治療條件下都有很強的穩定性。

Fig 5. 黑色素瘤患者的縱向血液樣本中可以檢測到匹配的克隆

6. 細胞表面marker聯合用于檢測患者血液中的TM成分

為了找到合適的用于富集TM細胞的marker，研究者再次使用COMET。經過篩選，研究者發現了四個低表達基因LTB、CCR7、GYPC和FLT3LG，在不同腫瘤負荷和治療條件下都有穩健的預測準確性。此外，研究者還發現兩個陽性marker，KLRD1和LGALS1。為了提高這些marker從血液中分離TM細胞的性能，研究者將它們聯合嘗試。在所有樣品中，兩個或多個基因比單標記的敏感性和特異性顯著提高。最后，研究者還使用GLIPH2和iSMART兩個工具對TCR重新聚類，并再次驗證marker的穩定性，得到了與之前相近的結果。

Fig 6. 鑒定用于跨患者追蹤TM細胞的標記組合

結論

本研究使用單細胞轉錄組+TCR測序方法，利用TCR序列作為分子條形碼來檢測和表征MC38腫瘤小鼠和黑色素瘤患者的血液中的TM CD8⁺ 細胞。
得到以下結果：
1. 與血液中的非匹配T細胞相比，TM細胞具有更強的活化作用，而且與腫瘤中相匹配的細胞相比有更低的耗竭性。

2. 已經被用于識別循環抗腫瘤CD8⁺ T細胞的PD-1，識別TM細胞時敏感性較差。

3. 在小鼠和患者中確定了TM細胞的候選細胞表面marker，并在小鼠中證實了其中的NKG2D、CD39和CX3CR1。

這些數據結果表明，TCR可用于鑒定與腫瘤相關的細胞，揭示TM細胞獨特的轉錄特性，以及開發用于追蹤和分析這些細胞的marker panel。

參考文獻
Pauken, Kristen E et al. “Single-cell analyses identify circulating anti-tumor CD8 T cells and markers for their enrichment.” The Journal of experimental medicine vol. 218,4 (2021): e20200920.