樣本收集手冊，微生物、微生物培養基的收集方法及注意事項
1.微生物收集方法
- 細胞數量：
需要細菌的數量為 1*107 cells（此為一次實驗的用量，最好收集兩次實驗的用量，分兩個離心管存放）。
- 取樣時間：
細菌生長指數中期（mid-log）
- 適用菌屬：
大腸桿菌（E.coli）[1,2]
- 取樣步驟：
1. 對細菌進行計數，計算1*107個菌體所需要的培養液的體積，記錄為1體積；
2. 快速收集1體積細菌培養液，并迅速在4℃條件下離心（1000 g， 10min）使細菌與培養液分離；
3. 除去上清培養液， 將細菌快速浸入液氮中進行淬滅，30s；
4. 淬滅后在冰上解凍，用1體積PBS 緩沖液（需預冷）洗去殘留的培養液，然后離心（1000 g，4℃, 10min）盡可能將全部的 PBS 緩沖液去除；
5. 保存在-80℃冰箱中。
- 適用菌屬：
酵母菌及非絲狀真菌 [3]
- 取樣步驟：
1. 對細菌進行計數，計算1*107個菌體所需要的培養液的體積，記錄為1體積；
2. -20℃下預冷淬滅溶液（甘油鹽溶液，pure glycerol and sodium chloride solution (13.5 g/L) to a final ratio of 3:2 (v/v)），準備4體積；
3. 迅速轉移1體積細菌培養液至上述4體積淬滅溶液中；
4. 快速搖勻溶液后，放入冰水浴中約5min；
5. 使用冷凍離心機，-20℃條件下離心（36086 g，20min）；
6. 盡可能將全部上清移除，保存于-80℃冰箱中。
- 注意事項：
1. 寄送樣本時請放入足量的干冰以保持低溫條件（根據過往項目經驗：快遞途中干冰消耗率約為 5KG/天，消耗速度與氣溫，泡沫箱厚度(>5cm)有直接關系，請酌情添加干冰）；
2. 微生物代謝速度非常快，因此所有的步驟需要盡快完成；
3. 不同樣本收集的微生物數量應一致。
收集方法參考文獻：
[1] Bertini I, Hu X, Luchinat C. Global metabolomics characterization of bacteria: pre-analytical treatments and profiling [J]. Metabolomics, 2014, 10(2):241-249.
[2] Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69.
[3] Kathleen F Smart, Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography– mass spectrometry, nature protocols | VOL.5 NO.10 | 2010.
2.微生物培養基收集方法
- 樣品量要求：
200ul/sample, 提供兩份樣本并分2個離心管存放（條件允許最好500ul/sample）
- 樣本收集步驟：
1. 將培養液搖勻，快速從培養瓶中取出一定量的培養液，4℃條件下離心（1000 g，10min）；
2. 移取上清 500ul 至新的離心管中, 迅速放入液氮中淬滅，30s；
3. 淬滅后放入-80℃冰箱中保存。
- 注意事項：
寄送樣本時請放入足量的干冰以保持低溫條件（根據過往項目經驗：快遞途中干冰消耗率約為 5KG/天，消耗速度與氣溫，泡沫箱厚度(>5cm)有直接關系，請酌情添加干冰）。
收集方法參考文獻：
[1] Silas G.Villas-Boas, Extracellular metabolomics: A metabolic footprinting approach to assess Wber degradation in complex media ，Analytical biotechnology, 2005.
[2] Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69.
[3] Farhana R. Pinu, Analysis of Intracellular Metabolites from Microorganisms: Quenching and Extraction Protocols, Metabolites, 2017.
小伙伴們發現了嗎？代謝組學樣本收集還是有些小規律的。為了檢測的準確性，樣本量要足夠；為避免引入誤差和雜質，經手人要少；由于檢測的是取樣時樣本的代謝物，所以樣本一定要淬滅；最后為了避免反復凍融，強烈建議各位科研達人將樣本進行分裝。
最后按照慣例附上我司協助客戶以微生物胞內、胞外為樣本發表的部分文章，供各位老師參考查閱
