四血管阻塞全腦缺血模型

缺血性腦損傷是目前中樞神經系統損傷性疾病研究的熱點，建立穩定和易操作的動物模型是缺血性血管病研究的基礎。目前研究最多的是 Pulsinelli大鼠全腦缺血四血管模型，是最經典的腦缺血動物模型之一，近年來被許多學者所使用。此方法能夠有效地模擬臨床中出現的因低血壓休克及心肺腦復蘇而導致的大腦缺血性損傷，且該模型具有較好可重復性，因此大批量用于基礎實驗。

1.動物選擇

• 大鼠

對于四血管阻塞模型，比較理想的動物為 Wistar大鼠。品系好壞、是否為同一供應商和動物的周齡是影響實驗成功率的幾個重要因素。體重在250~300g的年輕大鼠成功率較高，而且四血管阻塞模型穩定性更好。由下表可知，一般選擇Wistar大鼠作為實驗動物。

• 小鼠

小鼠體型小，椎動脈分離阻塞困難，因此常采用蒙古沙土鼠。沙土鼠也是最早用于全腦缺血研究的動物。沙土鼠的優點是天生缺少兩條后交通動脈，因此后循環不會代償前循環，只需結扎兩側頸總動脈即可實現全腦缺血。但是，因為Willis環存在變異，只有30%-40%的小鼠能成功實現全腦缺血，而75%的沙土鼠在結扎一側頸總動脈后就會造成心臟驟停。但沙土鼠比較難購買到。

2.手術操作步驟

基本的四血管阻塞模型

用異氟醚麻醉后，使大鼠平躺在手術臺上，用呼吸麻醉維持動物的麻醉狀態。

• 頸動脈周圍放置阻塞設備

(1)頸部腹側正中劃開一傷口，使其皮膚分開。

(2)雙手操作小彎鑷將覆蓋在頸部腹側的肌肉及其他組織分開，暴露實驗動物的頸總動脈。

(3)將迷走神經和頸交感神經鏈輕輕撥開，分離出頸總動脈，操作期間防止破壞神經。

(4)將阻斷裝置一根硅管(外徑15mm，內徑8mm，長10~15cm)分別松散地扣在頸總動脈上，并穿過紐扣的兩個小洞。

(5)硅膠管兩次穿過塑料管兩端，將管子打結，系緊形成一個環。環的長度應該比塑料管的長度要小，這樣就可以用來做阻塞裝置了。因此，當硅管通過塑料管拉緊后，將和按鈕共同阻斷頸動脈血流。

(6)用1~2根手術線縫合傷口。

• 電凝椎動脈

(1)將大鼠固定在立體定位架上，從頸背枕骨到第2頸椎(長約1cm)做一切口。剝離椎旁肌肉，暴露第1頸椎的翼孔。目的是充分暴露翼孔，可以在大鼠尾部系一根橡皮筋適當拉長頸椎。

(2)把雙極電凝器鑲嵌進入翼孔，永久燒灼椎動脈。電凝這一步是缺血成功的關鍵。如果加熱過久會損傷下頸椎腦橋，增加死亡率；反之，若時間過短，不能完全電凝阻斷椎動脈，導致缺血不完整。目前，沒有十分完美的方法來檢測椎動脈是否永久閉塞。筆者的經驗是，利用像注射器針頭那樣帶有尖頭的小探頭，插入阿拉爾孔，稍微彎曲，如果出血，則需要再電凝一次。也可以用結扎的方式阻斷椎動脈。

椎動脈結扎

(a)暴露第一頸椎，顯露左側翼孔(箭頭處)

(b)(c)插入電凝器，凝閉左側椎動脈

(d)顯露右側翼孔(箭頭處)

(e)(f)插入電凝器，凝閉右側椎動脈

(3)縫合傷口，將實驗動物放入舒適的籠內休息

• 雙側頸總動脈阻塞

(1)第2天繼續手術(禁食過夜，同時血糖水平一致)，首先使其露出腹側頸部。

(2)去除腹側頸部的手術縫線，牽拉塑料管中的硅管，然后系緊硅管，完全阻止頸總動脈的血流。

(3)驗證缺血成功。如果缺血成功，1min后大鼠將失去翻正反射。在整個手術過程中，大鼠體溫由一個連有直腸溫控探頭的加熱墊維持在37℃。

(4)阻塞一定時間后，松開系緊的結并恢復血流，這里說的一定時間取決于所要研究的大腦區域，動物將在短時間內恢復血流。

3.四血管阻塞1天模型(記錄缺血去極化狀況)

大腦溫度是影響缺血后細胞死亡嚴重程度的關鍵因素。另一個潛在的因素是頭部和頸部肌肉產生的側支血管。這種改進后的四血管阻塞模型將腦部溫度維持在37℃，以缺血去極化為是否完全缺血的指標。

• 手術準備

(1)除在管子打結處綁手術縫線外，阻斷頸總動脈和電凝椎動脈的步驟與前面所述相同。

(2)在頭骨的一側鉆一個洞，目的是放入一個溫控探頭。

(3)將直徑為8mm溫控探頭輕輕地放入頭骨下硬腦膜上，將體溫維持在37℃。

(4)在所需要研究的腦部另一側再打一個洞。海馬定位的坐標是前囟前(AP)5.0mm，旁開(ML)2.5mm；紋狀體定位的坐標是前囟前(AP)9.5mm，旁開(ML)3.0mm(耳間)。

(5)用尖頭鑷子剝掉硬腦膜，通過滴加生理鹽水維持腦部濕潤。

(6)在腹側頸部的開口處皮膚下放置一個參比電極(銀線)。

• 缺血去極化

(1)準備一個玻璃微電極，并使該尖端為5~10m。用2mol氯化鈉溶液灌注電極。

(2)緩緩將微電極伸到該區域(海馬DV2.5mm，紋狀體DV3.0mm)。

(3)將記錄電極和參比電極連接到放大器上，調整直流電源（direct current，DC）電勢到0mV。

(4)基礎測定1~2min，拉線阻塞雙側頸總，將線結固定在塑料管的凹痕中，如果缺血成功，0~20 mV的DC電勢將在2~3min后瞬間下降。

(5)研究海馬時，ID測定10min后應放松阻塞的線；研究紋狀體時，ID需測定20min。1~2min后DC電勢應該回復到0 mV。

(6)移去電極，用手術夾子閉合傷口。

4.注意事項及常見問題解答

• 注意事項

癲癇是一種腦缺血后常見的并發癥。缺血損傷程度和持續時間與癲癇的發病率呈正相關。在Wistar大鼠中，20min缺血可能誘發20%-30%的大鼠癲癇發作。癲癇發作引起的大腦損傷與缺血損傷不同，因此，缺血后癲癇發作的動物必須被找出并剔除實驗。判別癲癇的一種方法是觀察籠子里的墊料是否被動物濺到籠子外。手術并發癥同樣值得引起注意，包括腦脊液滲漏等，這將導致減壓效應以及額外的組織損傷。

全腦缺血對實驗動物損傷很大，同時模型的成功并不是很好的量化。實驗期間動物的死亡會影響實驗的科學分組與實驗的進程，所以要求盡量選擇身體狀況相同、年齡相近的大鼠作為實驗對象，同時要求實驗者規范模型制作過程，不可出現偏差。

• 常見問題及解決方法

死亡率

大約10%的大鼠在缺血過程中死亡，或者于再灌注后不久死亡，即使是操作者技術很熟練也會出現這種情況。2~3min阻塞過程中的呼吸衰竭是造成缺血后動物死亡的一個主要原因。立即復蘇一般能救活動物。再灌注后大鼠的死亡可能源于嚴重的腦缺血和腦血栓。此外，脖子和頭部的手術創傷會增加死亡率。除 Wistar外的其他品系死亡率可能更高。

解決方法

盡管結果可重復，不同動物的四血管阻塞模型結果可能不同，即使是成功缺血的動物間，兩個半球腦損傷程度也不盡相同，實驗效果不能完全量化一致。

許多因素影響缺血性結果，包括腦血管側支循環、腦溫、腦葡萄糖水平、麻醉、氧分壓和二氧化碳分壓等。重要的是要嚴格控制變量和優化實驗條件，有助于獲得穩定一致的結果。

*以上內容部分源自《實驗卒中模型方法學》
書號：ISBN 978-7-313-21776-9

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