最近很多小伙伴向我們咨詢各種Caspase的底物，今天小艾就來跟大家好好聊聊Caspase家族及各類Caspase酶對應的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依賴性天冬氨酸定向蛋白酶）是一類蛋白酶家族，其功能與凋亡（程序性細胞死亡），壞死和發燒（炎癥）的過程密切相關。

 

 

什么是胱天蛋白酶？

 

胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它們是為細胞凋亡的主要介質。多種受體，例如TNF-α 受體，FasL受體，TLR和死亡受體，以及Bcl-2和凋亡抑制劑（IAP）蛋白家族參與并調節該caspase依賴性凋亡途徑。一旦Caspase受到上游信號（外部或內在）刺激被激活，即會參與執行下游蛋白底物的水解作用，并觸發一系列事件，導致細胞分解，死亡，吞噬作用和細胞碎片的清除。

 

人Caspases酶

 

人的Caspases家族基于序列相似性和生物學功能等共性主要可分為三大類：第一類由具有長胱天蛋白酶募集結構域的“炎癥”胱天蛋白酶組成，他們對P4位上的較大的芳香族或疏水性殘基具有親和力。第二類由具有短的前體結構域的“細胞凋亡效應”胱天蛋白酶組成，而第三類由具有長的前提結構域的Pap位置具有亮氨酸或纈氨酸底物親和力的“凋亡引發劑”胱天蛋白酶組成（表1）。

 

表1. 人胱天蛋白酶的功能分類：

 

細胞死亡途徑	半胱天冬酶類型	酵素	物種
細胞凋亡	啟動器	Caspases 2	人與鼠
細胞凋亡	啟動器	Caspases 8	人與鼠
細胞凋亡	啟動器	Caspases 9	人與鼠
細胞凋亡	啟動器	Caspases 10	人的
細胞凋亡	效應器	Caspases 3	人與鼠
細胞凋亡	效應器	Caspases 6	人與鼠
細胞凋亡	效應器	Caspases 6	人與鼠
細胞焦亡	炎性的	Caspases 1	人與鼠
細胞焦亡	炎性的	Caspases 4	人的
細胞焦亡	炎性的	Caspases 5	人的

 

啟動器Caspase和效應器Caspase酶

 

根據其在凋亡胱天蛋白酶途徑中的作用，胱天蛋白酶可分為兩類：啟動器和效應器Caspase酶。啟動器和效應器Caspas酶都具有由小亞基和大亞基組成的催化位點，Caspase酶的識別位

 

 

凋亡啟動器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以啟動caspase激活級聯反應。Caspase-8對于形成死亡誘導信號復合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效應子Caspase（例如Caspase 3）并介導線粒體中細胞色素c的釋放。Caspase-8已被證明對IETD肽序列具有相對較高的底物選擇性。凋亡效應胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7雖然不負責啟動級聯途徑，但是當被激活時，它們在級聯的中間和后續步驟中起著不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是關鍵效應器，因為它放大了來自啟動器Caspase的信號，使用對Caspase-3有選擇性的DEVD肽序列對活化的Caspase-3進行檢測，可以檢測Caspase-3的活性。

 

 Caspase酶底物和抑制劑

 

Caspase底物和抑制劑由兩個關鍵成分組成：Caspase識別序列和信號產生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase識別序列不同，一般由三個或四個氨基酸組成（表2）。Caspase酶識別序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基團修飾，以增強膜的通透性。對應的Caspase識別特定的肽序列為其酶促反應切割位點，釋放產生信號或抑制信號的基序。Caspase的顯色和熒光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信號或顏色強度與蛋白水解活性成正比。

 

Caspase酶的顯色底物

 

Caspase的顯色底物是有Caspase識別序列及生色基團組成，常見的生色團有pNA（對硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶標儀或分光光度計在405 nm處進行光密度檢測。

 

Caspase的熒光底物

 

Caspase的熒光底物的結構包含與半胱天冬酶識別相關的熒光團，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于兩步裂解過程，其動態范圍更窄。 建議將R110標記的Caspase底物用于終點法測定，而將AMC和AFC標記的 Caspase底物用于動力學測定。

 

Caspase的熒光底物

 

圖.從左到右，分別是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激發和發射光譜。

 

注意：

ε=在其最大吸收波長處的摩爾消光系數（單位= cm -1M -1）。

Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產率。

 

Caspase抑制劑

 

Caspase抑制劑能與Caspase的活性位點結合并形成可逆或不可逆的連接，通常，Caspase抑制劑的結構由Caspase識別序列，諸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能團組成。具有醛官能團的胱天蛋白酶抑制劑是可逆的，而具有FMK的抑制劑是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制劑都具有較小的細胞毒性作用，因此，它們是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

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