使用說明：
1.樣品準備
a. 樣品的準備請按下列流程進行操作：
(a)細胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b)對于血清樣品，將全血在室溫下放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c)對于血漿樣品，采集的全血建議使用EDTA進行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d)若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復凍融。
b.血清樣品不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑。
c.樣品應(yīng)清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。
d.請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結(jié)果將不準確。
注：血清或血漿樣品需要用樣品分析緩沖液倍比稀釋后再檢測。
2.檢測前準備工作
a.試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25-28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。
b.配制適當量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
c.按標準品標簽上標注的體積加入標準品稀釋液至1瓶標準品中，室溫孵育15分鐘(為確保標準曲線的準確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標準品徹底溶解，使標準品終濃度達到1000pg/ml。通常每個濃度的標準品需要檢測2個孔，每個孔的標準品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標準品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標準品，并在合并混勻后使用。
d.取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預先加入250μl的標準品稀釋液，并參考圖2進行標準品的倍比稀釋，最終得到1000、500、250、125、62.5、31.25pg/ml共六個標準品濃度，最后將稀釋好的標準品依次加入預包被板孔中，標準品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標準品濃度。

圖2. 標準品倍比稀釋示意圖。按標準品(STANDARD)標簽上標注體積加入標準品稀釋液溶解并混勻后的濃度為標準品的起始濃度。其它的倍比稀釋后的濃度依次為起始濃度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。
3.洗滌方法
自動洗板機或手工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣在厚吸水紙上適當用力拍干。
4.實驗過程需自備的材料和儀器
a.不同規(guī)格的移液槍及相應(yīng)的吸頭
b.酶標儀
c.自動洗板機(如果沒有也可以手工洗板)
d.去離子水或雙蒸水
5.操作步驟
a.計算并確定一次實驗所需的預包被板條數(shù)，取出所需板條放置在96孔框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。
b.每次實驗都需配制標準品并繪制出標準曲線，同時建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔，設(shè)置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。
c.分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl/孔加入相應(yīng)孔中，用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育120分鐘。對于血清血漿樣品的ALCAM的檢測，請先加入50ul的樣品分析緩沖液后再加入50ul樣品(注：此時樣品相當于已經(jīng)被稀釋了2倍)。如果樣品濃度過高超出檢測范圍，請先加入50ul的樣品分析緩沖液，再加入50μl稀釋后的樣品。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)。
注意：請先查閱相關(guān)文獻確定樣品中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標準品濃度，請適當稀釋或濃縮后再進行檢測。
d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
e.加入生物素化抗體100μl/孔(注：此生物素化抗體已經(jīng)預先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育60分鐘。
f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
g.加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根過氧化物酶標記Streptavidin已經(jīng)預先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時(低于25℃)，需要適當延長孵育時間。
h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
i.加入顯色劑TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育15-20分鐘。室溫偏低時需要適當延長孵育時間，此時可以孵育至標準品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化，若樣品濃度足夠高也會出現(xiàn)顯著的顏色變化。
j.加入終止液50μl/孔，混勻后立即測量A450值。
6.結(jié)果分析
a.復孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復孔平均值可作為測量值。
b.每個標準品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。
c.繪制標準曲線。以標準品濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過樣品的吸光度值和標準曲線計算出樣品的相應(yīng)濃度。

圖3. Human CCL11/Eotaxin ELISA Kit的標準曲線。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
d.若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重新測定，計算濃度時需注意乘以樣品的稀釋倍數(shù)。