第89-101步

徠卡101

染色

從患者到病理學家，準備樣本進行診斷需要細心、經驗以及合理的流程。

徠卡特地為大家整理了取材、組織脫水、透明、浸蠟、包埋以及染色等（常規、特殊、IHC以及FISH）101步操作流程，幫助大家更有效、更簡單地獲得實驗方案，避免錯誤的發生。
 

步驟八十九

使用高質量切片

🙆正確：使用薄的，切片平整的切片，需將其在玻片上充分干燥。免疫組化和原味雜交宜使用帶電荷粘附載玻片。

🙅 錯誤：不平整，貼合不平整的切片的染色不均勻，背景會被不同程度染色。

這張低質量染色的切片（HPV）有凸起及背景染色。
 

步驟九十

確保最佳固定方式

🙆 正確：必須使用熟悉和恒定的固定條件（固定類型，pH，溫度，時間）獲得優質固定，以達到最佳結果。

🙅 錯誤：不穩定的固定條件會導致樣本固定不足或固定過度，會使得實驗結果不穩定并且無法排查問題原因。

A.在充分固定的扁桃體切片上進行 Kappa輕鏈mRNA原位雜交反應強烈，顏色銳麗。

B.在沒有充分固定的扁桃體切片上進行 Kappa輕鏈mRNA原位雜交，反應十分微弱。
 

步驟九十一

避免組織粘附

🙆 正確：避免在撈片設備中使用蛋白質成分粘附劑（膠水，淀粉，明膠），特別是在使用帶電荷的載玻片的時候。

🙅 錯誤：蛋白質成分粘附劑會覆蓋在帶電荷載玻片的表面，造成組織粘附不均勻，使得原位雜交試劑從凸起切片的下方流出，導致染色不均一。

切片粘附不完全和折疊導致染色不均一（HPV）。
 

步驟九十二

優化脫蠟和試劑應用

🙆正確：在脫蠟和水化時，一定要保證試劑高效均一的分布在樣本表面。這樣才能保證染色均一，結果恒定。

🙅 錯誤：脫蠟不完全會導致無法染色或染色不佳。前處理和染色過程中在樣本表面形成的氣泡也會產生問題。

95°烤片形成氣泡導致染色不均一（HPV）。
 

步驟九十三

認真挑選探針

🙆 正確：根據探針特異性和敏感性進行選擇。

🙅 錯誤：“我們只根據價格購買探針。”

兩張扁桃體切片都使用原位雜交對kapa輕鏈mMA進行染色(BcIP/NBT)。兩張切片使用寡核苷酸探針來源不同。切片A顯色強烈而切片B顯色不足并只有部分細胞被染色。
 

步驟九十四

閱讀參數表

🙆 正確：了解你的探針。一定要檢查參數表，來確認當前的實驗方法是否適用于特定的探針。仔細控制溫度和時間，提供最優化的雜交條件。即該條件下，探針和目標的特異結合最大化。

🙅 錯誤：不了解探針數據表：“我們用標準流程就行”。

兩張濕疣切片都使用原位雜交對HPV進行染色。兩張切片使用同樣的DNA探針，但是雜交條件不同。切片A顯色強烈而切片B顯色失敗。
 

步驟九十五

優化預處理條件

🙆 正確：選擇合適的預處理和優化條件。取決于固定條件和組織類型。

🙅 錯誤：對不同的探針使用同樣的酶預處理條，有時會導致染色體結果不佳。

這張切片使用 Poly d（T）陽性對照探針進行染色。染色結果表明這張切片被蛋白酶K過度消化。不但造成粘液上皮細胞質結構缺失，而且背景染色過重。
 

步驟九十六

仔細處理組織

🙆正確：仔細處理組織樣本并及時固定可以限制由內源性RNA酶導致的RNA損失。

🙅 錯誤：處理組織時粗心大意，固定不及時，將會促進由內源性RNA酶導致更多的RNA損失。

扁桃體組織用 Poly d（T）陽性對照探針進行染色，由于RNA酶降解RNA導致的染色不足。
 

步驟九十七

使用合適的顯色系統

🙆正確：選擇靈敏的顯色系統，優化孵育條件。

🙅 錯誤：即使探針已與目標結合，顯色系統靈敏度不夠也可能導致染色不足，甚至陰性結果。

該扁桃體切片染色不足是由于顯色系統靈敏度不夠造成的。Lambda輕鏈的原位雜交使用了非聚合物的顯色系統。

 

步驟九十八

避免試劑蒸發

🙆正確：在孵育過程中應避免探針和其他試劑的蒸發。由于需要長時間孵育，試劑干結是一個常見問題。必須使用高質量儀器。

🙅 錯誤：如果探針和其他試劑干結（通常在邊緣處），干結處將形成過重和非特異染色。

該扁桃體切片用原位雜交對 kappa輕鏈進行顯色。切片在甲酰胺雜交過程中變得過干，導致實驗結果不穩定，產生非特異性反應。
 

步驟九十九

清洗步驟標準化

🙆正確：將整個流程的清洗步驟標準化（包括：持續時間，清洗液體積，攪動方式），如此可保證穩定的試驗結果。

🙅 錯誤：同一探針在不同批次和日期的結果差異很大，這可能是由于操作者在清洗步驟上不夠標準造成的。

這2張扁桃體切片用原位雜交對 kappa輕鏈進行顯色。切片A顯示過重的背景染色，而切片B背景清晰，這有可能就是由于切片A的清洗不足而造成的。
 

步驟一百

使用合適對照

🙆正確：每一批次都使用合適的對照。對照應包含陽性對照和陰性對照，陽性對照為已知陽性的組織，陰性對照是使用非特異探針的檢測組織。

🙅 錯誤：“我們只在試驗出現問題時才會使用質控片。如果每一輪實驗都做質控片的話,大家沒有耐心去看的。”

這張切片使用 Poly d(T)陽性對照探針進行染色。精確的染色表明該組織固定良好，RNA序列保存完整。

步驟一百零一

認真評估結果

🙆正確：評價染色后的切片和對照時，知道觀察什么、觀察哪里。任何一個承擔原位雜交的工作人員都應該對該技術的原理有基本的了解，應知道哪里能找到陽性染色。

🙅 錯誤：無論在切片何處發現染色，都表明該次染色是成功的。

除了添加探針外，該扁桃體陰性對照切片完成了所有的原位雜交步驟。它表現出了鐵血黃素，該物質天然即為棕色并可與DAB結合加深顯色，這并非陽性染色。

本期是我們徠卡101樣本診斷流程小貼士的最后一次分享，感謝大家一直以來的關注，我們希望通過這段時間的閱讀，傳遞學術知識，并能夠解決困擾大家的問題。未來我們還將帶給大家更多的精彩！