基于報告基因生物學活性探索方法
瀏覽次數：4080 發布日期：2020-10-27
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| 近年來，隨著生物藥物的快速發展，報告基因法逐漸應用于生物藥的生物學活性檢測之中。通常是在充分理解藥物分子藥理機制的基礎上，構建相應的細胞模型，通過激活待測藥物參與的信號通路產生生物效應，從而反映藥物的生物學活性。 |
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| 報告基因法是通過分子生物手段將報告基因整合入待測的生物系統中，繼而通過檢測報告基因產生的信號，研究特定生物學過程的方法。在實際操作中通常是將報告基因與目的基因或調控序列連接，如將報告基因置于特定啟動子調控序列之后，研究某種條件下啟動子的調控或特定基因調控下目的蛋白的表達。作為報告基因，其序列和功能通常已知且其表達產物易于被檢測。目前已鑒定并商品化的報告基因有氯霉素轉乙酰酶( CAT)、 β-半乳糖苷酶( β-gal)、β-葡萄糖苷酸酶( p-GUS) 、分泌型堿性磷酸酶( SEAP)、熒光素酶(LUC)、綠色熒光蛋白( GFP)等。 |
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| 藥品有效性必須是療效確切，且含有特定的有效活性成分及一定的濃度含量。在藥物研發的過程中，為了評價藥物的有效性和臨床應用價值，生物學活性的測定是重要的手段之一。現階段的生物學活性分析方法主要是在體外檢測，大多以細胞為基礎進行研究。近年來，隨著生物藥物的快速發展，報告基因法逐漸應用于生物藥的生物學活性檢測之中。通常是在充分理解藥物分子藥理機制的基礎上，構建相應的細胞模型，通過激活待測藥物參與的信號通路產生生物效應，從而反映藥物的生物學活性。 |
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01：抗 HER2 單克隆抗體 ADCC 生物學活性的測定 |
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| 人表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）基因編碼了一個跨膜酪氨酸激酶受體家族中的受體蛋白。 |
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| 該蛋白在正常情況下處于非激活狀態，主要在胚胎發育時期表達，成年后僅在少數正常組織中微量表達，參與細胞的分化調控。已有研究表明，HER2 的過表達與腫瘤的發生有密切的關聯，在乳腺癌，卵巢癌，胃癌等癌癥中均存在不同程度的 HER2 過表達。因此 HER2 是腫瘤免疫治療研究中的一個重要靶點。 |
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| 在 HER2 單抗類藥物的作用機制里，單抗可作為ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）的潛在介質，與淋巴細胞表面受體結合進而激活效應細胞對腫瘤靶細胞的殺傷。 |
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| 在經典的 ADCC 測定方法中，是將靶細胞暴露于結合單抗的效應細胞中,如外周血單核細胞（PBMC）或自然殺傷細胞（NK），通過檢測細胞毒性判定 ADCC 活性。但該方法依賴原始的效應細胞，原始效應細胞的提取繁瑣，個體差異明顯，容易造成較高的背景值。將 Jurkat 細胞做工程改造，以 NFAT 應答元件驅動的熒光素酶報告基因檢測系統為平臺則成功的避免了傳統方法的弊端，并可以快速準確的檢測單抗的生物學活性。 |
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| 構建 Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT 細胞株并進行篩選鑒定，以 SKBR3（乳腺癌細胞系）作為靶細胞。向 SKBR3 細胞板內接種 Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT 細胞，并加入不同濃度梯度的單抗溶液。將細胞板置于 37℃、5% CO2條件下誘導 20h 后加入熒光素酶底物溶液，避光反應 5min 后使用酶標儀讀取熒光信號，所得的數據使用四參數擬合方式，R2>0.99，如圖 1，EC50 為 13.27 ng·mL-1。 |
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圖 1 建立抗 HER2 單抗的 ADCC 劑量效應曲線 |
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圖 2 利用報告基因法比較 3 株不同的 HER2+ 靶細胞 |
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如圖 2，以不同的 HER2+ 的人乳腺癌細胞系 SKBR3、BT474 及 MCF7 作為靶細胞進行 ADCC 活性檢測，發現 SKBR3 細胞呈現更好的劑量效應。 |
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02：免疫檢查點抑制劑——PD1/PD-L1 抗體的生物活性學檢測 |
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| 研究表明 PD-1 主要限制慢性炎癥、感染或癌癥中的 T 細胞活性，PD-1 有兩個配體，PD-L1和PD-L2。在腫瘤的微環境中，腫瘤細胞能夠表達 PD-L1或者 PD-L2。癌細胞逃避免疫系統摧毀的一種方法，是通過配體聯接到T細胞的 PD-1 蛋白上。當配體與 PD-1 聯接以后，T細胞就不能夠發現腫瘤和向免疫系統發出攻擊腫瘤的信號。針對 PD-1 分子的負性免疫調節治療癌癥的研究曾于 2018 年榮獲諾貝爾生理學或醫學獎，目前抗 PD-1 單抗及抗 PD-L1 單抗越來越成為各國抗體研發中炙手可熱的治療性單克隆抗體，作為免疫檢測點靶向抗體，可以用于治療黑色素瘤、晚期腎 細胞癌、晚期（轉移性）非小細胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、皮膚癌等腫瘤。 |
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| PD1 藥物的設計思路是：給予腫瘤患者針對 PD-1 或 PD-L1 的一種抗體蛋白質，將使兩種蛋白質不會聯接，T細胞的功能也不會關停，且 PD-1 通路的抑制會加速和加強自身免疫。 |
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| 為了驗證抗體藥物的生物學活性，研究人員構建了分別構建轉基因效應細胞系和靶細胞系（如下所示） |
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| 效應細胞系： |
| Jurkat-hFcγＲⅢa-NFAT |
| ( 穩定轉染 FcγＲIIIa 及 NFAT 反應元件） |
| 靶細胞系： |
| 293FT-PD-1 ( 穩定轉染 PD-1 分子） |
| CHO-PD-L1 ( 穩定轉染 PD-L1 分子） |
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| 將 Jurkat-hFcγＲⅢa-NFAT 效應細胞系分別加入到293FT-PD-1和 CHO-PD-L1 細胞中，并對應加入不同濃度的抗 PD-1 單抗和抗 PD-L1 單抗溶液。誘導20h后加入熒光素酶底物，在 Molecular Devices 酶標儀上讀取相對光單位( relative light unit，RLU） 數值并按以下公式計算誘導倍數( fold of induction， FI) 。FI = RLU( 反應均值－背景均值) /RLU( 陰性對照均值－背景均值） ; 利用 SoftMax 軟件分析試驗數據，以單抗濃度對數為 x 軸，對應的 FI 值為 y 軸，選用四參數方程回歸模型，擬合單抗的劑量效應曲線。 |
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圖3 抗PD-1/PD-L1 單抗的 ADCC 劑量效應曲線 |
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研究人員用該檢測方法分別確定了效靶比，誘導時間等（圖4和圖5）。 |
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圖4 抗 PD-1/PD-L1 單抗不同效靶比對比結果 |
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圖5 抗 PD-1/PD-L1 單抗不同效靶比及誘導時間的信噪比結果 |
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由于很多生物藥沒有強反應性的細胞系或者沒有易檢測的細胞學效應，基于報告基因構建轉基因細胞系指示藥物活性成為很好的選擇。中國食品藥品檢定研究院有豐富的報告基因測定大分子藥物生物學活性的技術儲備，已經率先建立了多品種的報告基因測活方法，包括干擾素、促胰島素分泌肽融合蛋白、促紅細胞生成素以及抗 VEGF 靶點抗體的熒光素酶報告基因方法。這一系列的研究結果突破了傳統生物活性檢測的限制，為保證用藥的安全性，時效性，提高檢驗質量提供了保障。 |
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