文章導讀
外泌體是細胞分泌的大小為30-200nm的盤狀囊泡，它在人體體液中分布廣 泛。2013年，科學家通過研究外泌體細胞囊泡調控機制獲得諾貝爾獎，這使外泌體開始被廣 泛關注，隨著研究的深入，人們發現外泌體可作為細胞間信息交流的橋梁，在細胞間往來穿梭進行信息傳遞。另外，外泌體與疾病的發生尤其是在腫 瘤中起到十分關鍵的作用，因此，外泌體也成為了研究疾病以及靶向治 療的切入點。
盡管外泌體的研究十分火熱，但前期研究主要集中在外泌體的信息傳遞以及外泌體中microRNA的作用機制等方面，關于外泌體中環狀RNA的研究仍方興未艾，今 天小編就近日新發表的三篇外泌體環狀RNA高 分文章進行解析，希望能夠使大家對外泌體中的環狀RNA的研究有一些新的認識。

文章展示
1.肝ai細胞來源的外泌體circUHRF誘導自然殺傷細胞的衰竭，影響抗PD1治 療的耐藥性
發表期刊：Molecular Cancer
影響因子：15.302
發表時間：2020.6.27
文章鏈接：Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma
2020年6月27日，Molecular Cancer（IF=15.302）雜志上發表了一篇題為“Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma”的文章，文中對肝ai（HCC）細胞分泌的外泌體中circUHRF1的研究發現，circUHRF1可以通過與miR-449c-5p形成海綿機制從而影響其下游基因TIM-3的表達，結果顯 示抑 制自然殺傷細胞（NK）功能并提高了抗PD1免疫療法的耐藥性。
（1）circUHRF1在肝ai組織中表達上調
通過環狀RNA測序數據分析得到UHRF1在肝ai組織中表達上調，并在其病理過程中起重要作用。后通過qPCR技術檢測HCC中的標志基因UHRF1來源的14個circRNA，發現hsa_cic_0048677(circUHRF1)是肝ai組織中表達量第 一高的環狀RNA。并且在HCC組織中circUHRF1的表達高于非腫 瘤組織。臨床生理表型顯示circUHRF1表達高的患者中腫 瘤體積較大，血液中NK細胞比例較低，微血管浸潤較多。Kaplan-Meier生存分析顯示，circUHRF1高表達患者伴隨臨床預后不良。綜上所述，HCC細胞中circUHRF1表達上調與患者預后不良相關，并表明circUHRF1表達上調可能參與了HCC的進展。

 

（2）肝ai細胞可以通過外泌體分泌circUHRF1
作者從六種肝ai細胞系中分離并利用電鏡（TEM）和WB鑒定了相應的外泌體。qPCR顯示HCCLM3和SMMC-7721細胞系衍生的外泌體circUHRF1的表達第 一高。為了研究circUHRF1是否可以由HCC細胞通過外泌體遞送到HCC患者血漿中。進行了qPCR鑒定了血漿外泌體circUHRF1，結果顯示HCC患者血漿外泌體circUHRF1水平較高，腫 瘤切除后血漿外泌體circUHRF1水平降低，腫 瘤復發患者血漿外泌體circUHRF1水平升高，說明血漿外泌體circUHRF1主要由HCC細胞產生。此外，外泌體circUHRF1水平的升高常伴隨著NK細胞比例降低。上述數據表明，外泌體circUHRF1可能是決定NK細胞相關免疫逃避的關鍵分子。 （ 3）肝ai細胞通過外泌體circUHRF1抑 制NK細胞功能
為確定HCC細胞衍生的外泌體circUHRF1是否可以誘導NK細胞功能異常，作者將NK細胞與HCCLM3和SMMC-7721細胞進行共培養。結果表明，與SMMC-7721和HCCLM3細胞共培養的NK細胞中分泌IFN-γ和TNF-α受到抑 制且circUHRF1表達的顯 著增強，但這兩種作用可以被外泌體抑 制劑GW4869所阻斷。為進一步研究HCC細胞是通過外泌體circUHRF1介導NK細胞功能障礙，作者利用shRNA敲低了SMMC-7721和HCCLM3 細胞中circUHRF1的表達，qPCR顯示在敲低circUHRF1的肝ai細胞中，外泌體circUHRF1的表達顯 著降低，從而改善NK細胞中IFN-γ和TNF-α的分泌受損。這些結果說明，HCC通過外泌體circUHRF1抑 制NK細胞功能。 （4）circUHRF1通過miR-449c-5p相關途徑來抑 制NK細胞功能
作者利用生物信息學預測了14個miRNA，在NK-92細胞中進行circUHRF1-RIP以及qPCR，結果表明miR-449c-5p是NK-92細胞中一個與circUHRF1相互作用的miRNA。在NK-92細胞中進行抗AGO2抗體的RIP和生物素化miR-449c-5p的RNA pull-down實驗，證明了circUHRF1可以直接與miR-449c-5p結合。此外經雙熒光素酶報告實驗和分別在NK-92細胞中過表達circUHRF1和miR-449c-5p，證明了在NK細胞中circUHRF1和miR-449c-5p可能相互靶向。此外單獨過表達miR-449c-5p會顯 著抑 制腫 瘤的活性，但增加circUHRF1表達顯 著抑 制miR-449c-5p的腫 瘤抑 制功能，說明HCC衍生的外泌體circUHRF1通過miR -449c-5p相關途徑抑 制NK細胞功能。 作者分析了NK細胞中預測的miR-449c-5p靶基因TIM-3，同樣進行了雙熒光素酶報告實驗，結果顯示miR-449c-5p能直接與靶基因TIM-3的3’UTR區直接結合。超表達miR-449c-5p后TIM-3表達顯 著降低。為了驗證NK細胞中外泌體circUHRF1的持續上調吸附miR-449c-5p，從而導致TIM-3的表達上調造成HCC的免疫逃避這一觀點。作者檢測了miR-449c-5p單獨或與circUHRF1共同轉染的NK-92細胞中TIM-3的表達。結果顯示，miR-449c-5p超表達導致TIM-3 mRNA和蛋白表達水平下降，而circUHRF1逆轉了miR-449c-5p的抑 制作用。在體內同樣證實了circUHRF1通過調控miR-449c-5p/TIM-3軸來阻礙NK細胞的功能。 （6）circUHRF1以NK細胞依賴性方式促進HCC進展
為了進一步探討circUHRF1在HCC中的作用，使用pLO5-ciR-circUHRF1上調了PLC / PRF / 5細胞中circUHRF1的表達。qPCR結果顯示，在過表達circUHRF1的HCC細胞中，外泌體circUHRF1水平也顯 著上調。此外，使用PLC/PRF/5細胞構建肺轉移的NOD/SCID小鼠模型(注射來自健康供者的NK細胞)。結果表明，在接種過表達circUHRF1細胞的肺轉移小鼠內，血漿外泌體中circUHRF1水平更高，肺部的轉移瘤結節更多及結節內NKG2D陽性細胞更少。說明，circUHRF1以外泌體和NK細胞依賴性的方式促進HCC進展。 （7）circUHRF1可以提高肝ai對抗PD1治 療的耐藥性
分析了30例進行肝切除術并接受抗PD1免疫治 療的HCC患者的資料并測定circUHRF1的表達水平，結果表明，PD組的circUHRF1水平明顯高于SD組和PR組。此外，檢測了30例HCC患者組織中NKG2D的表達水平。結果表明，與抗PD1治 療敏感的HCC患者相比，抗PD1治 療耐藥的HCC患者中NKG2D的陽性細胞數明顯減少。為直接評估circUHRF1對抗PD1治 療的影響，通過皮下植入circUHRF1基因敲低的HCCLM3細胞或相應的陰性對照細胞來構建小鼠移植瘤模型。結果表明，植入circUHRF1基因敲低細胞的小鼠對抗PD1治 療敏感，并伴隨總生存率的提高。根據上述研究，過表達circUHRF1可以提高HCC對抗PD1治 療的耐藥性，而靶向circUHRF1可能是恢復HCC對抗PD1治 療敏感性的有效方法。 2. 外泌體circSHKBP1通過調控miR-582-3p/HUR/VEGF過程以及抑 制HSP90降解來促進胃ai發展
發表期刊：Molecular Cancer
影響因子：15.302
發表時間：2020.6.29
文章鏈接：Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation
2020年6月29日，“Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation”，文中闡述了circSHKBP1能夠在胃ai患者的腫 瘤和血清中高表達，并且可以被外泌體遞送，通過海綿吸附miR-582-3p并抑 制HSP90的降解從而起到促ai作用，為胃ai（GC）的發病機理研究提供了新的理論基礎。 （1）circSHKBP1在GC組織中顯 著上調
作者首先通過外泌體環狀RNA測序在8例GC組織和8例正常組織的樣本中 共鑒定出119種差異表達的circRNA。qPCR發現circSHKBP1是GC中差異表達很是顯 著的circRNA。設計反式剪切位點引物擴增circSHKBP1并進行Sanger測序和RNase R實驗，驗證表明circSHKBP1是高度穩定的環狀RNA。對來自GC患者的152對ai組織和正常組織進行ISH分析發現GC組織的circSHKBP1豐度遠高于正常組織，且circSHKBP1的表達與晚期TNM分期、血管浸潤和預后不良相關。
（2）血清外泌體的circSHKBP1來源于GC組織
為了確定是否可以在血清外泌體中檢測到circSHKBP1，作者收集了20對GC組織和健康組織的血清外泌體，通過電鏡（TEM）和WB發現，胃ai患者血清外泌體來源的circSHKBP1比健康對照組更豐富。血清外泌體中circSHKBP1水平約為GC患者腫 瘤組織中circSHKBP1水平的6倍。研究胃切除手術前后血清外泌體的circSHKBP1水平，發現切除腫 瘤后外泌體circSHKBP1水平急劇下降，說明GC組織是外泌體circSHKBP1的來源。以上結果表明，circSHKBP1是一種來源于胃ai組織的circRNA，可以被外泌體有效地輸送到循環系統中。此外，circSHKBP1的高表達與晚期TNM分期和GC預后不良相關，使其具有作為GC潛在分子標志物的潛力。 （3）GC來源的外泌體circSHKBP1在體外能促進GC細胞的增殖、遷移和侵襲
為了探索circSHKBP1是否影響GC細胞的生物學過程，分析了circSHKBP1在4種人GC細胞系（BGC823、HGC27、AGS和MGC803）和正常胃上皮細胞系GES1中的表達水平。結果表明，circSHKBP1在4個GC細胞系中均高表達。此外，來自BGC823細胞培養基的外泌體circSHKBP1在GC細胞系中也存在過表達。隨后，以circSHKBP1反向剪接序列的siRNA來敲低circSHKBP1，用pcDNA3.1-CMV-circRNA載體構建circSHKBP1過表達質粒。CCK8和EdU檢測和Transwell檢測顯示，沉默circSHKBP1顯 著抑 制GC細胞增殖、遷移和侵襲能力而過表達circSHKBP1則相反。此外，作者從轉染了circSHKBP1質粒的BGC823和HGC27細胞培養液中提取外泌體，與未處理的GC細胞共培養。結果表明，外泌體circSHKBP1的過表達也影響了GC細胞的增殖、遷移和侵襲。綜上所述，過circSHKBP1能促進GC細胞的增殖、遷移和侵襲并且隨著circSHKBP1在GC細胞中的表達，更多的circSHKBP1通過外泌體中干擾其他GC細胞的生物學功能。  （4）circSHKBP1可通過海綿機制吸附miR-582-3p
鑒于circRNA海綿吸附miRNA的作用已被廣 泛研究，且circSHKBP1在胞質中含量豐富，作者探索了circSHKBP1是否通過作為miRNA的海綿分子來發揮生物學功能。對BGC823細胞中的AGO2進行RIP，結果顯示內源性circSHKBP1特異性地富集于AGO2。使用CircInteractome預測可以與circSHKBP1結合的潛在miRNA分子（miR-582-3p、miR-665、miR-1207和miR-4458）。qPCR、RNA pull-down和雙熒光素酶報告實驗證實只有miR-582-3p可以直接與circSHKBP1互作。綜上所述，circSHKBP1可以充當miR-582-3p的海綿分子并降低miR-582-3p的表達。隨后作者將miR-582-3p單獨轉染或與circSHKBP1質粒共轉染到GC細胞中。CCK8和Transwell分析表明，miR-582-3p會抑 制GC細胞的增殖、遷移和侵襲，而過表達circSHKBP1則消除了它對GC細胞生長的抑 制作用，這表明circSHKBP1是通過海綿吸附miR-582-3p來發揮的促ai作用。 （5）circSHKBP1通過上調HUR來促進VEGF的翻譯
分析臨床數據發現circSHKBP1高表達組的血管浸潤率顯 著較高。使用生信分析網站找到了miR-582-3p的下游靶標HUR和EIF2S1，它們是VEGF（促進內皮細胞增殖）信號通路的一部分。WB分析顯示，過表達circSHKBP1會促進HUR和VEGF的表達，而對EIF2S1無影響。此外，miR-582-3p模擬物可以降低BGC823細胞中HUR和VEGF的表達。同樣，敲低circSHKBP1下調了HUR和VEGF，隨后導入miR-582-3p抑 制劑可以恢復HUR和VEGF的表達水平。HUR的RIP實驗證實，它可以與VEGF mRNA和miR-582-3p直接結合。檢測GC組織中HUR mRNA的表達水平，發現HUR表達與miR-582-3p表達呈負相關，與circSHKBP1表達呈正相關。結果表明，circSHKBP1可以通過調節HUR來調控VEGF的表達。 （6）circSHKBP1直接HSP90相互作用并抑 制其降解
在HGC27細胞中用circSHKBP1探針的RNA pull-down和蛋白質譜結果顯示兩個差異表達蛋白HSP90β和HSP90α（HSP90的異構體）在過表達circSHKBP1的GC細胞中富集。RIP實驗顯示，circSHKBP1能直接作用于HSP90。使用qPCR和ELISA分別檢測HSP90的mRNA和蛋白水平，結果顯示GC腫 瘤組織中的HSP90 mRNA和蛋白均上調且HSP90蛋白表達與circSHKBP1表達呈正相關。然而，在過表達circSHKBP1中使用CHX抑 制蛋白，HSP90的降解受到明顯抑 制。由于泛素連接酶STUB1可以泛素化HSP90。使用蛋白酶體抑 制劑MG132處理時HSP90的降解速度減慢。結合上述研究，作者認為circSHKBP1和STUB1競爭性結合HSP90，通過IP分析獲得證實。此外，HSP90的抑 制劑NMS-E973在體外削弱了circSHKBP1的促ai作用。這些結果表明，circSHKBP1可以直接與HSP90結合，并抑 制STUB1對HSP90的泛素化，從而促進GC的發展。 （7）circSHKBP1調節體內GC的生成
作者構建了circSHKBP1沉默株系（LV3-sh1、LV3-sh2）和超表達株系（LV5-circSHKBP1），將相應細胞接種到小鼠體內，發現源自LV3-sh1細胞的腫 瘤明顯小于源自LV3-NC的，表明敲低circSHKBP1會抑 制腫 瘤生長。另外，將轉導LV5-circSHKBP1和LV5-NC的細胞接種到裸鼠體內，并對每組中一半數量的小鼠每周給予兩次VEGF抗體。發現源自LV5-circSHKBP1細胞的腫 瘤比源自LV5-NC細胞的腫 瘤更大且更重。此外，qPCR 鑒定血清外泌體和腫 瘤的circSHKBP1的表達，發現外泌體circSHKBP1依賴于ai組織circSHKBP1的表達，這證實了circSHKBP1可通過外泌體遞送到其他部位，并可在循環系統中檢測，這使其可能成為一種很有潛力的GC分子標志物。 （8）circSHKBP1調控體內GC的轉移
為了探索circSHKBP1對體內胃ai轉移的影響，作者將熒光素轉染到上述5個細胞系，然后注入裸鼠體內。LV5-circSHKBP1和LV5-NC組中的一半的小鼠每周接受兩次VEGF抗體處理。結果表明，敲低circSHKBP1可顯 著減少肺轉移灶的數目和大小且ISH顯示，敲低circSHKBP1會導致GC肺轉移灶中的HUR和VEGF染色明顯減少。而過表達circSHKBP1可以加重肺轉移病變和增加HUR和VEGF染色。而VEGF抗體可以抑 制circSHKBP1誘導的ai細胞轉移。 3. 外泌體circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p- TGF- cm1過程驅動大腸ai的惡化
發表期刊：Molecular Cancer
影響因子：15.302
發表時間：2020.7.27
文章鏈接：Exosomal circPACRGL promotes progression of colorectal cancer via the miR-142-3p/miR-506-3p- TGF-β1 axis
2020年7月27日，發表于Molecular Cancer（IF=15.302）的“Exosomal circPACRGL promotes progression of colorectal cancer via the miR-142-3p/miR-506-3p- TGF-β1 axis”首 次揭示了來源于腫 瘤細胞外泌體的circPACRGL在大腸ai增殖和轉移中的作用機制，為深入研究circRNA在大腸ai治 療中的作用機制提供了新的理論依據。 （1）大腸ai（CRC）來源的外泌體可刺激CRC增殖、遷移和侵襲
為了探索外泌體在CRC中的作用機制，作者首先從CRC細胞系HCT116和SW480的上清液中分離出ai細胞衍生的外泌體。CCK8、傷口愈合實驗和Transwell assay顯示，過表達外泌體顯 著增強了CRC細胞的增殖、遷移和侵襲。流式細胞儀分析顯示，在過表達外泌體的CRC細胞中，凋亡細胞數目顯 著低于對照細胞，WB結果顯示，CRC衍生的外泌體增加了ai細胞相關的蛋白水平。此外，測試了CRC衍生的外泌體在體內轉移瘤模型中的作用，作者發現外泌體處理顯 著增加了HCT116細胞的轉移。綜上所述，CRC衍生的外泌體可促進CRC增殖、遷移和侵襲。 （2）添加腫 瘤來源的外泌體后，circPACRGL在大腸ai細胞中顯 著上調
通過外泌體環狀RNA測序分析了HCT116和SW480細胞外泌體（Ex-HCT116和Ex-SW480）的表達譜。Venn顯示circPAGAL（也稱為has_circ_0069313）是兩個Ex組中上調特為顯 著的基因，并通過qPCR證實。qPCR顯示在腫 瘤來源的外泌體刺激下，CRC細胞中circPACRGL的表達顯 著上調，且circPACRGL可能來源于腫 瘤衍生的外泌體。為了研究circPACRGL是否為CRC進展所必需的，作者進行了功能缺失分析，將circPACRGL-siRNA轉染到HCT116和SW480細胞中敲低circPACRGL后，使用腫 瘤來源的外泌體刺激兩種CRC細胞，顯示circPACRGL mRNA表達顯著增加。這些結果表明，circPACRGL主要來自腫 瘤來源的外泌體。 （3）circPACRGL作為海綿分子結合miR-142-3p和miR-506-3p
作者使用生物信息學數據庫預測發現circPACRGL同時具有miR-142-3p和miR-506-3p的結合位點，雙熒光素酶報告實驗檢測也證實miR-142-3p和miR-506-3p可與circPACRGL直接結合。此外，在CRC細胞來源的外泌體刺激的HCT116和SW480細胞中，miR-142-3p和miR-506-3p表達均顯 著降低。這些結果表明，circPACRGL可以海綿吸附miR-142-3p和miR-506-3p，并抑 制二者的表達。 （4）miR-142-3p / miR-506-3p均可調節 TGF-β1
使用生物信息學預測了miR-142-3p和miR-506-3p的下游靶基因TGF-β1。通過雙熒光素酶報告實驗，證實了TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p的共同靶基因。qPCR和WB分析進一步表明，轉染miR-142-3p/miR-506-3p可顯 著降低TGF-β1的mRNA和蛋白水平。為了進一步證實miR-142-3p和miR-506-3p對TGF-β1的調節作用，作者使用miR-142-3p/miR-506-3p 處理CRC衍生的外泌體刺激的CRC細胞，結果顯示導入CRC衍生的外泌體后，CRC細胞中TGF-β1的mRNA和蛋白水平均顯 著增加，而與miR-142-3p/miR-506-3p共同處理后，TGF-β1表達的促進作用被有效抑 制。綜上所述，TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p的共同靶標。 （5）circPACRGL通過海綿機制吸附miR-142-3p /miR-506-3p進而調控TGF-β1促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲
根據以上數據，作者推測circPACRGL可能通過miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1軸來調控CRC細胞增殖、遷移和侵襲。CCK8結果顯示，在CRC衍生的外泌體治 療組（Ex-HCT116）中，CRC細胞增殖明顯高于對照組。敲低circPACRGL顯 著降低了CRC細胞增殖，而miR-142-3p/miR-506-3p抑 制劑處理或過表達TGF-β1后，這種抑 制作用會相應減弱。在細胞凋亡實驗中也觀察到了類似的效果。接下來，劃痕實驗和Transwell分析均顯示CRC衍生的外泌體可以增強CRC細胞的遷移和侵襲能力，而在circPACRGL敲低的細胞中則發生了相反的作用，CRC衍生的外泌體處理可以回補circPACRGL敲低細胞的遷移和侵襲能力。與CCK8和細胞凋亡檢測結果一致，miR-142-3p / miR-506-3p抑 制劑處理或過表達TGF-β1顯著促進了circPACRGL敲低細胞的遷移和侵襲能力。以上結果表明，circPACRGL通過調節miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1過程促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲。 （6）來源于CRC的外泌體circPACRGL通過miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1過程調節N1-N2中性粒細胞的分化
上述研究表明，circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1過程促進大腸ai的發展。作者進一步探討CRC衍生的外泌體circPACRGL是否也可以通過這個軸調節中性粒細胞的N1-N2分化。流式細胞儀檢測結果顯示，CRC衍生的外泌體可以增加N2中性粒細胞的百分比，這與N2標記物CD11b + / Ly6G + / Ly6Clow的上調相一致。相比之下，在circPACRGL敲低的細胞中，N2中性粒細胞的百分比顯著降低，而加入CRC衍生的外泌體后，這種抑 制作用被取消。此外，miR-142-3p/miR-506-3p抑 制劑處理或過表達TGF-β1可以顯 著增加circPACRGL敲低細胞中N1-N2的分化。綜上分析，CRC衍生外泌體的circPACRGL通過miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1過程促進N1-N2中性粒細胞的分化。 總結
總體來說，上述三篇研究通過外泌體提取、外泌體鑒定、外泌體環狀RNA測序、qRT-PCR、Sanger測序、RNA pull-down+MS/WB、RIP以及雙熒光素酶報告實驗等方法（云序可提供以上服務），探究外泌體環狀RNA通過海綿機制吸附miRNA進而調控下游疾病相關基因mRNA的表達過程，結果影響ai癥發展進程。這為研究和理解生物體復雜的外泌體環狀RNA調控機制，提供了比較完整的實驗研究思路和方案，具有很強的理論先導性和示范性，也為疾病的調控和靶點提供了重要的理論依據。