利用單細胞打印機提高單克隆效率和可靠性的有效方案
單細胞的分離具有非常廣泛的應用，抗體藥物的研發和生產、單細胞基因組學到細胞系的開發。然而面對單細胞克隆分離日益增長的實驗需求，目前常用的方法或從效率方面，或者從可靠性方面并不盡人意：傳統的有限稀釋法基于泊松分布，依賴于統計概率，工作量大且效率低下；基于流式細胞術的單細胞分選更是由于其低的細胞復蘇率而被詬病，其次儀器使用還要受累于嚴格的培訓，繁復的清洗和維護工作。盡管如此，這兩種方法都不能從分離的過程中即得到單細胞來源的證明，只能單純依賴孔板掃描成像設備對結果拍照以后才能獲得克隆單細胞來源證據。
Cytena Single-Cell Printer是一款非常高效的單細胞分離設備，通過Cytena SCP分離單細胞不僅能夠有高的單細胞獲得率，獲得的單細胞的生長率也非常高，儀器通過優異的光學系統，能夠對每個成功被獲得的單細胞在分離的過程中跟蹤拍照，留下單細胞來源的證據，結合孔板掃描設備成像結果，相互佐證單細胞來源，可以使單細胞可靠性高達99.9%。機器使用一次性的耗材，免去了大量的清洗和驗證工作，操作簡單，無需復雜維護。
下文中介紹了一種單細胞打印機結合孔板成像的實驗流程，實驗中使用有限稀釋法作平行對照，證明儀器的高效可靠性。
材料和方法：
樣品準備：
指數生長期的CHO-K1 細胞 (來源于ATCC)，輕柔離心去除培養基后，重懸于無菌PBS溶液中，密度調整為1x106cell/mL，為避免細胞團塊兒，在上樣至打印芯片前，通過40um篩網過濾(其他類型細胞處理方法相同)。
Cytena SCP單細胞打印分離：
上樣：取準備好的細胞樣品60ul加入一次性無菌打印芯片中，芯片安裝好即可以啟動打印過程。
參數設定：在開始打印前可以設定目標單細胞的圓度，直徑 和熒光信號強度范圍（F.sight），因為瀕死細胞或不健康細胞的直徑和圓度通常會發生變化，此功能能夠提高獲得優質單細胞的概率（見圖1）。如果對細胞的大小圓度或者熒光強度不熟悉，儀器還提供樣品數據收集分析功能，可以簡單快速的獲得樣品數據的分布情況，以指導設置合適的參數區間。
圖1
圖2
單細胞分離：儀器使用獲得專利的類似噴墨的柔和分液系統產生均勻液滴，使用雙攝像頭系統分別對液滴進行質控和液滴中的細胞進行甄選（F.sight 中的熒光檢測的功能可以對液滴中細胞的熒光強度進行檢測），快速分離到符合要求的單細胞（圖2）至鋪有克隆培養基的384孔板中（儀器也支持96孔板）。
分離的單細胞來源證據: 在對細胞分離篩選的過程中，對于每一個被獲得的單細胞，在其靠近噴嘴區，系統確認單細胞事件，即對其進行靠近-進入ROI區域-通過噴嘴區的過程進行跟蹤拍照，留下單細胞源證據（圖3）。后續多孔板在經過孔板成像設備掃描成像后可以與此圖片證據相互佐證，驗證單細胞的準確性。
圖3
有限稀釋對照：
取準備好的細胞樣品，通過細胞計數儀計數后，使用克隆培養基進行系列稀釋，接種密度為0.3cell/孔，在384孔板中接種80ul細胞稀釋液。
結果統計與分析：
使用多孔板成像設備在Day0拍照統計單細胞打印機分離獲得的單細胞率數據，之后進行跟蹤拍照至7天后肉眼可見的克隆團出現，統計單克隆生長率。
單細胞率：
使用同一個打印芯片，分了兩個384孔板，平均的單細胞率為92.6%，兩細胞孔和空孔率分別為5.0% and 0.4%（見圖4）,分完每板所用的時間平均為20min。
圖4
克隆生長率：
分離得到的單細胞的分裂生長能力是很關鍵的數據，體現細胞在經過分離過程以后的活力情況，可以驗證分離的方法是否對細胞產生了負面影響，有限稀釋法被認為是對細胞的影響最小的單細胞分離方法。單細胞打印機分選的細胞生長情況（圖5A）：326個孔含有單細胞克隆，5個孔是兩個細胞來源的克隆，32個孔沒有細胞。有限稀釋法的多孔板鋪板后生長到第7天的克隆生長情況（圖5B）：44個孔是單細胞克隆孔，6個孔是多個細胞的克隆孔，334孔是空細胞孔。單細胞打印機分離的單克隆生長率高達84.6%，遠遠高于平行的有限稀釋法（10.5%）（分裂生長的單克隆數/總的單細胞孔數*100%）。
圖5
結論：
通過實驗證明，Cytena單細胞打印機可以實現對單細胞的高效分離，獲得高的單細胞率，且分選過程對細胞無損傷。通過軟件對相關參數設定，篩選出狀態好的細胞，來確保后期的高克隆生長率，同時分離過程留下單細胞來源證據，非常適合細胞系的開發工作，提高工作效率。
艾貝泰是Cytena單細胞打印機的中國代理，了解詳細產品信息請與我們聯系。
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