近年來國內(nèi)外關(guān)于干細胞的研究取得了重大的突破，而這其中最熱門的研究當屬間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）。MSC是一類具有自我更新和多種分化潛能的成體干細胞，來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層未成熟的胚胎結(jié)締組織。1968年德國科學(xué)家Frieden Stein在骨髓中首次發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細胞（MSC），后來研究者陸續(xù)在全身多種組織如脂肪、臍帶、牙髓中分離出了MSC。MSC屬于多能干細胞，具有多向分化潛能，1999年，《科學(xué)》雜志首次報道了Pittenger等科學(xué)家在體外成功誘導(dǎo)了骨髓MSC分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞，此后，科學(xué)家又陸續(xù)成功誘導(dǎo)MSC分化成為肌肉、韌帶、肝、心肌和內(nèi)皮等多種其它細胞（如下圖）。

 

目前，MSC的鑒定主要通過形態(tài)學(xué)觀察（如呈纖維細胞樣生長，細胞中央有卵圓形核，密度較高時呈渦旋狀或放射狀生長）、表面標志物檢測（如CD29、CD44等）以及多系分化潛能鑒定。這里的多系分化潛能通常指成骨、成脂和成軟骨分化，稱為MSC的三系分化。雖然目前MSC三系分化的誘導(dǎo)過程和鑒定方法都已經(jīng)相對成熟，但三系分化的原理可能還未被大家所熟知。為了更好地理解MSC的三系分化，本文初步總結(jié)了MSC三系分化的大概過程，分化過程中出現(xiàn)的一些標志物以及對應(yīng)的檢測方法。

 

1 骨髓間質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)分化

間質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化是理解骨形成機制的有力工具，它也被用于鑒別骨質(zhì)疏松癥、骨修復(fù)和成骨不全等遺傳紊亂疾病。

 

同其他組織器官一樣，骨組織也在不斷地進行著細胞代謝，稱為骨代謝。它可以大致分為骨形成和骨重塑兩個階段，前者在個體生長發(fā)育期起主要作用，后者則持續(xù)整個生命周期。成骨分化是骨生成的關(guān)鍵步驟，即骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)歷骨原細胞（osteoprogenitor cells）、成骨前體細胞（pre-osteoblasts）、成熟的骨細胞（osteoblasts）和終末階段的骨細胞（osteocytes）的一個復(fù)雜的過程，其中涉及到多種類型細胞間和細胞內(nèi)的信號傳遞，如信號通路、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、MicroRNA 等，形成了一個完整的骨代謝調(diào)控負反饋環(huán)路。不同階段的細胞群之間無明顯的界限，它們是一個連續(xù)發(fā)生發(fā)展的過程。具體過程如下：

1）多種刺激因子和激素的刺激及其他特定的理化因素作用下，間充質(zhì)干細胞定向分化為骨原細胞；

2）其后，骨原細胞進一步分化為成骨細胞前體細胞，進入快速增殖期;

3）細胞增殖能力逐漸下降，細胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）成熟相關(guān)基因（堿性磷酸酶、I型膠原、基質(zhì)鈣蛋白）被進一步激活，成骨細胞在此階段合成和分泌有機基質(zhì)，形成類骨質(zhì)，主要由I型膠原形成，特征物是堿性磷酸酶，是成骨細胞分化成熟的早期標志；

4）成熟的成骨細胞表達ECM鈣化相關(guān)蛋白，主要是骨鈣蛋白和骨橋蛋白，成骨細胞礦化活力顯著升高。

 

與成骨分化的體內(nèi)過程相對應(yīng)的，體外誘導(dǎo)成骨分化的鑒定主要是通過檢測成骨細胞的生物學(xué)標志以及相關(guān)的標志基因來進行的。短期的成骨分化可通過堿性磷酸酶來檢測，長期的成骨分化則通過檢測茜紅素染色骨結(jié)節(jié)來鑒定。具體檢測以下三種物質(zhì)：

1）堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）：堿性磷酸酶經(jīng)固藍染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)藍色，未分化的細胞則無明顯顏色。可通過統(tǒng)計各樣品中細胞堿性磷酸酶的平均表達強度對其成骨能力進行評估對比。可通過統(tǒng)計各樣品中成骨分化細胞的百分比加以對比或統(tǒng)計ALP染色照片的平均灰度（固定各項拍攝參數(shù)）進行對比，還可通過溶解藍色物質(zhì)后測吸光度。

2）“鈣結(jié)節(jié)”：長時間的成骨誘導(dǎo)會使鈣離子以鈣鹽方式沉淀下來，形成“骨結(jié)節(jié)”。骨結(jié)節(jié)可通過茜素紅染色（茜素紅和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色化合物），把外面沉積的鈣結(jié)節(jié)染成深紅色，通過著色物面積和深淺來表示成骨分化的強弱。

3）MSC成骨分化后明顯的成骨細胞特征性基因，如ALP，Runx（runt related gene II）等。可使用RT-PCR對比不同實驗組別的成骨分化差異。

賽業(yè)生物長期致力于干細胞領(lǐng)域的研究，在干細胞的誘導(dǎo)分化中有專業(yè)的技術(shù)及豐富經(jīng)驗，依賴于成熟的干細胞技術(shù)平臺，我們可以開展多種干細

胞成骨誘導(dǎo)分化潛能研究的實驗服務(wù)。下圖是賽業(yè)所做的骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化誘導(dǎo)圖，圖中深紅色部分為鈣結(jié)節(jié)。

 

2 骨髓間質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化

脂肪組織由脂肪細胞組成，對保持能量和代謝平衡非常重要。脂肪組織有兩種，一種為白色脂肪組織（WAT），主要分布在皮下和內(nèi)臟，內(nèi)臟白色脂肪與肥胖、病理驗證和胰島素抵抗相關(guān)，皮下白色脂肪則可提高葡萄糖耐受性；另一種為棕色脂肪組織（BAT），主要呈離散狀分布在脊椎旁、鎖骨和腎上腺，功能是產(chǎn)熱。這兩種脂肪組織有相同的分化特征，都是由間充質(zhì)干細胞分化而來。

 

間充質(zhì)干細胞成脂分化有兩個階段，先是MSC分化為脂肪前體細胞，接著在特定的細胞刺激影響下（如C/EBPs和PPAR-γ）最終分化為脂肪細胞，出現(xiàn)脂肪細胞中顯著的標志物（脂肪滴），如下圖：

 

體外誘導(dǎo)成脂分化的鑒定

1.檢測成脂誘導(dǎo)后細胞的胞漿中的油滴（脂肪滴）。脂肪滴經(jīng)油紅O染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)顯著的紅色，未分化細胞則無明顯顏色。通過統(tǒng)計各樣品中成脂分化細胞的百分比來對成脂分化強弱加以表征對比。

2.MSC成脂分化后有明顯的成脂特征性基因表達，如LPL、PPARγ等。可使用RT-PCR通過對相關(guān)基因表達量的測量，對比不同實驗組別的成脂分化差異。

 

賽業(yè)生物長期致力于干細胞領(lǐng)域的研究，在干細胞的誘導(dǎo)分化中有專業(yè)的技術(shù)及豐富經(jīng)驗，依賴于成熟的干細胞技術(shù)平臺，我們可以開展多種干細胞成脂誘導(dǎo)分化潛能研究的實驗服務(wù)。下圖是公司所做骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂分化誘導(dǎo)圖，可以看到圖中有明顯的脂肪滴。

 

3 骨髓間質(zhì)干細胞成軟骨誘導(dǎo)分化

軟骨的破壞、缺失是包括骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）在內(nèi)的多種骨科疾病的重要病理改變。由于軟骨特殊的解剖及組織特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修復(fù)能力異常不足，因此通過人工方法修復(fù)軟骨破壞具有重要臨床意義。近年來，隨著間充質(zhì)干細胞的發(fā)現(xiàn)和研究深入，其來源廣泛、良好的增殖能力、多分化潛能、與各種3D支架材料具有良好的生物相容性等特性，使得其在軟骨修復(fù)應(yīng)用中具有令人期待的潛力。

 

MSC成軟骨分化的過程：MSC首先收回其突起，聚集成團，這個團中間的細胞經(jīng)分裂分化轉(zhuǎn)變成一種大而圓的細胞，即成軟骨細胞；成軟骨細胞產(chǎn)生基質(zhì)和纖維（主要為II型膠原蛋白），當基質(zhì)的量增加到一定程度時，成軟骨細胞被分隔在陷窩內(nèi)，分化為成熟的軟骨細胞。

 

體外誘導(dǎo)成軟骨分化的鑒定主要圍繞成軟骨的標志物——II型膠原蛋白來進行，包括通過免疫組化、Westernblot檢測II型膠原蛋白的表達和RT-PCR檢測II型膠原蛋白的mRNA的表達，不同的角度進行鑒定；而甲苯胺藍則主要檢測成軟骨細胞內(nèi)酸性粘多糖。

 

賽業(yè)生物長期致力于干細胞領(lǐng)域的研究，在干細胞的誘導(dǎo)分化中有專業(yè)的技術(shù)及豐富經(jīng)驗，依賴于成熟的干細胞技術(shù)平臺，我們可以開展多種干細胞成脂誘導(dǎo)分化潛能研究的實驗服務(wù)。下圖是公司所做骨髓間充質(zhì)干細胞的成軟骨分化誘導(dǎo)圖，可以看到軟骨細胞埋藏在軟骨間質(zhì)內(nèi)，它所存在的部位為一小腔，稱為軟骨陷窩（cartilage lacuna）。

 

自我更新能力和多向分化能力是干細胞的兩個最基本特征。干細胞誘導(dǎo)分化是干細胞鑒定的主要方法，也是干細胞功能學(xué)研究的主要途徑。賽業(yè)生物長期致力于干細胞領(lǐng)域的研究，在干細胞的誘導(dǎo)分化中有專業(yè)的技術(shù)及豐富經(jīng)驗，依賴于成熟的干細胞技術(shù)平臺，我們可以為您開展多種干細胞分化潛能研究的實驗服務(wù)。其中OriCell®干細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基針對干細胞多向誘導(dǎo)分化添加了特殊的誘導(dǎo)物質(zhì)，能高效促進干細胞分化；同時，針對不同種屬和來源的間充質(zhì)干細胞（MSCs）公司研發(fā)出了相應(yīng)的人間充質(zhì)干細胞檢測試劑盒、大鼠間充質(zhì)干細胞檢測試劑盒、小鼠充質(zhì)干細胞檢測試劑盒，以滿足大多數(shù)科研工作者的需要。

 

參考文獻

周雷，王明海，《成骨分化相關(guān)信號通路的研究進展》

張靜如，逢丹丹，戴生明《成骨細胞分化及調(diào)節(jié)過程》

虞翼哲董學(xué)海，陳海丹，趙紅衛(wèi)《間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于軟骨組織工程的研究進展》

Cristancho AG, Lazar MA. Forming functional fat: a growing understanding of adipocyte differentiation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;12(11):722-734. Published 2011 Sep 28. doi:10.1038/nrm3198