如何選擇合適細胞的消化酶-重組胰酶和動物源胰酶

瀏覽次數：3724　發布日期：2020-9-17　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

開學寄語

❤

培養細胞的老師們都知道

細胞的生命是極其脆弱的

在培養過程中有哪些行為是比較傷害細胞的呢？

在培養貼壁細胞過程中

消化過程在一定程度上是對細胞的一種折磨

但是又不得不進行這個過程

所以如何做好細胞消化

善待細胞們

是我們一定要了解的步驟~

胰酶的作用原理

胰酶是一種蛋白酶，酶切位點是肽鏈的Lys或Arg兩個殘基的羧基端肽鏈，通過在特定位置上降解蛋白，使細胞膜上和培養皿結合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時細胞由于自身內部細胞骨架的張力以及培養液表面張力的作用下成為球形。

使用胰酶時需注意的細節問題

在使用胰酶（Trypsins）細胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細菌污染。
胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長，否則細胞鋪板后生長狀況會較差，做流式時的CD Marker也可能會下降。
胰酶進行分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時液體體積會膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并可能造成污染。
胰酶適用于消化細胞間質較少的軟組織和傳代細胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對于纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。胰酶消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關。

❤ 注意：不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才表示消化好了。

一般肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙狀移動就可以了，這時就應該停止消化。

如何進行細胞消化

對大部分細胞消化來說，可以在消化到差不多快要脫落的時候，移除大部分胰酶，然后直接加新鮮的培養基將細胞吹打下來，省去離心步驟。殘余的胰酶含量很低，所以不會對細胞產生任何影響。
對于難消化的細胞，如HCT15, LS411和KM12，用不含Ca²⁺，Mg²⁺的PBS洗滌一次后，加入稍微多一點胰酶，置37ºC徹底消化（一般為幾分鐘）至脫落（一晃細胞就掉下來），然后再加培養基終止胰酶反應、離心 (若是無血清培養基，需改加胰酶抑制劑)。這么做的道理是，細胞消化不徹底，勢必會增加吹打輔助脫落的次數，而吹打次數越多，細胞活性越差。
若細胞消化過度，可以加入血清終止胰酶對細胞的繼續作用，因為血清中含有蛋白可與胰酶結合，利用競爭抑制原理，中和胰酶消化，不能直接用胰酶吹打。應加入過量血清，約為胰酶的1-2倍，然后離心去上清，培養基重懸，這時應該注意將細胞吹散，因為一般胰酶消化過度之后細胞容易聚集成團，不吹散的話會嚴重影響細胞狀態。吹打不宜過猛，20下左右，肉眼完全看不到顆粒狀懸浮后再吹幾下即可。

如何選擇正確的細胞消化試劑

BI提供動物來源的傳統胰酶及基因工程生產的重組胰蛋白酶。

貨號：03-079-1B

動物胰酶普遍用于血清培養，不同的細胞加入胰酶的成分和濃度不一樣。貼壁不牢和半貼壁細胞盡量使用濃度0.05%不含EDTA的胰酶且不需要放在培養箱孵育，這樣易于控制，對細胞的傷害也降到最低。對于難消化的細胞就需要使用含EDTA的0.25%的胰酶，而不是無限地延長消化時間。
EDTA有什么作用呢？許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA聯合作用。胰酶切割ECM負責粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca²⁺，抑制Integrin的貼壁活性，所以EDTA的作用更加溫和。
重組胰酶用于無血清培養。重組胰酶具有與動物源性胰蛋白酶相同的酶學性質，但是不含任何動物源成分，可替代胰蛋白酶使用（常用于細胞治療）。
BI生產的重組胰酶Recombinant Trypsin EDTA Solution ，堪稱傳統胰酶的完美替代者。無雜酶，無外源性或內源性病毒污染，無PMSF（蛋白酶抑制劑）、EDTA等任何蛋白酶抑制劑，較傳統的胰酶使用方便，在細胞培養實驗中減少了很多不必要的操作，細胞培養效果大大提高。