COVID-19從2019年末到現在，影響者我們每一個人。我們每一位生物醫藥人，也都在不同行業為新冠抗疫努力著。


閑談Immunology新冠相關文章回顧

2013年作者因為工作需要，一直在甲流H7N9防控的第一線，形成一個直覺：流感或其他呼吸道病原體，如果引起呼吸窘迫多與細胞因子風暴相關。
因而于2月5日，在公眾號發表：細胞因子風暴綜合征臨床特點及治療藥物; 有超過1.2萬人閱讀，之后多個公眾號轉載，累計超過10萬人閱讀。


2月12日發表：泛冠狀病毒藥物開發的基礎知識，希望能夠給藥物研發的科學工作者，從實驗動物到策略選擇提供一些參考。

2月17日發表：病毒免疫逃逸機制--誘導免疫細胞凋亡、衰老和耗竭，警示小心病毒通過各種機制逃避免疫，和病毒的戰斗是一個長期的過程。


之前的人感染冠狀病毒，呈季節性流行趨勢，多從12月開始，次年4月慢慢結束，對溫濕度較為敏感，參考閱讀：呼吸道病毒季節性流行的原因與預防

SARS-CoV-2夏季，在我國之外大范圍流行，顯示這個規律被打破了，專家也提示，我們可能需要長時間關注SARS-CoV-2流行，做好個人防護。


近日作者又著手開始寫一些新冠的文章，希望大家一起來關注和回過來思考一些問題：

大范圍人群疫苗免疫后，新冠病毒再度流行時，是否會因為ADE而增加感染。8月26日發表：抗體依賴增強作用（ADE）免疫學基礎和抗體疫苗開發的提示。


COVID-19實驗室診斷

SARS-CoV-2實驗室診斷，主要涵蓋核酸檢測（qPCR，測序，核酸等溫擴增），抗原免疫學檢測（膠體金法為主），血清抗體免疫學檢測（膠體金或ELISA法），細胞因子風暴伴隨診斷（ELISA法，或者Luminex多因子檢測等）。
 

核酸檢測

基因測序

對于任何新發未知傳染病，需第一時間分離病毒株，進行基因測序。1. 得到準確的基因序列，是后續qPCR法，抗原抗體研發，和免疫檢測研發的基礎。2. 從進化樹上，追溯其可能來源。3. 明確病人是否多種病原體感染同時并存。
 

但是基因測序，對操作人員和分析人員要求高，時間長，成本高，不適合人群篩查。因而后續多轉用PCR法。大型實驗室，可以采用定量PCR（qPCR），社區或者野外，可以采用便攜式PCR等。

定量RT-PCR（Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）

獲得基因序列后，可以在極短的時間內，設計特異性引物，通過qRT-PCR進行檢測。通常，也是臨床上最早可以獲得的，進行大規模人群篩查的方法。

qRT-PCR特點

• 方法靈敏度足夠高，可以達到10拷貝/ml 以下（文獻1），

• 時間約2-4小時

• 疫情早期診斷主要方法（抗原抗體的開發需要時間）

• 假陰性（CT影像診斷陽性，核酸陰性）可能原因：突變引起的引物脫靶；鼻咽拭子取樣問題；樣本運輸問題等

環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）
LAMP作為POCT式的核酸檢測設備，在傳染病爆發期，可以大大增加檢測可及性（尤其是在技術欠發達地區，交通樞紐，機場等），以及檢測及時性。

• RT-LAMP的檢測靈敏度可以達到10拷貝

• 60-65℃等溫擴增

• 時間約15-40分鐘

• 儀器價格較qRT-PCR低

CRISPR-Cas RNA鑒定系統

CRISPR-Cas系統是鑒定平臺，主要用于鑒定RT-PCR或者RT-LAMP的擴增產物。具體原理和過程見下圖。

CRISPR-Cas聯合RT-LAMP技術，可以實現LoD：10拷貝/μL ，（90% 靈敏度100% 準確度）

圖片來源于文獻3

 

免疫學檢測

 

獲取基因序列之后，大量的上游原料廠商開始表達抗原，研發抗體。隨即抗原和抗體檢測試劑快速開發。主要的檢測方法有ELISA法，膠體金法，化學發光法，免疫熒光法等。其中膠體金法，作為POCT的方法，使用最為廣泛。

抗原檢測（膠體金法）
國內有多個產品上市，例如：

• 東方基因（Healgen)新型冠狀病毒快速檢測試紙（膠體金免疫層析法）；

• 萬孚生物（wondfo）2019-nCoV新型冠狀病毒抗原檢測試劑（免疫層析法）；

• 重慶業為基COVID-19新型冠狀病毒抗原檢測試劑盒（膠體金法）

特點：

• 快速：全程10-15分鐘

• 早期：和核酸一致

• 便利：無需儀器配套

• 靈敏度：5-10 TCID50/test

• 缺點：靈敏度不如核酸qRT-PCR法

• 用途：呼吸道病毒鑒別診斷

抗體檢測（膠體金法）
用于回顧性檢測，流行病學調查。

因為免疫流程，感染初期并不出現抗體，因而不適合疾病的早期篩查。一般適用于疾病的回顧性檢測，流行病學調查。另外，因為疾病消退后，抗原和核酸消失，但是抗體IgM和IgG半衰期長，因而回顧性研究，可以使用抗體血清學檢測。

新冠IgM/IgG抗體檢測試劑盒，有更多的廠家（萬孚，麗珠試劑等）提供，不做贅述。


細胞因子風暴檢測
細胞因子風暴是新冠肺炎病情危重的重要因素，因而在新冠肺炎診療方案中建議：有條件者可行細胞因子檢測。
細胞因子風暴檢測組合包含：IL-1β，IL-17A，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-10，TNF-α，IFN-γ，MCP-1，IP-10，GM-CSF等。

細胞因子本是Roche，西門子等體外診斷巨頭已有檢測項目，但多年來并不受關注，甚至沒有相關組合試劑提供，尤其是可以檢測所有項目的組合試劑。
在本次新冠期間，經典的多因子檢測品牌Luminex和基于流式細胞術的多因子檢測在臨床上占據了主導位置。

未來，傳統巨頭是否會增強其細胞因子檢測平臺，尤其是試劑提供嗎？畢竟，除了新冠，甲流等；CAR-T治療，免疫檢查點治療副作用檢測，細胞因子風暴也是非常重要的項目，是有一定市場體量的。

未來技術展望

新冠防控的薄弱點是人群聚集的公共區域，如菜市場，商城，交通工具等。如何對公共區域進行檢測，是一個難點，國內清華伯克利深圳研究院，南方科技大學，聯合羅切斯特理工學院的科學家，在ACS  infection disease上的文章，給了很多開創性的思路，如下圖，供大家參考。

 

喵評：上述方法，其實大家早已熟知。梳理一遍，主要幫大家了解不同技術的使用和開發背景。如果，有科學家能夠開發出公共區域病毒采集檢測預警系統，將會極大幫助現在和未來新發傳染病的公共預防控制。

 

參考文獻

1. Chan, J. F.-W.,, et al. (2020) Improved Molecular Diagnosis of COVID-19 by the Novel, Highly Sensitive and Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated in Vitro and with Clinical Specimens. J. Clin. Microbiol. 58,e00310-20.

2. Robin Augustine, et al, Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Rapid, Sensitive, Specific, and Cost-Effective Point-of-Care Test for Coronaviruses in the Context of COVID-19 Pandemic, Biology 2020, 9, 182

3. MEAGAN N. ESBIN et al, Overcoming the bottleneck to widespread testing: a rapid review of nucleic acid testing approaches for COVID-19 detection,RNA (2020) 26:771–783

4. D'Cruz RJ, Currier AW, Sampson VB，Laboratory Testing Methods for Novel Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2)，Front Cell Dev Biol . 2020 Jun 4;8:468

5. Xi Yuan, Chengming Yang, Qian He, Junhu Chen, Dongmei Yu, Jie Li, Shiyao Zhai, Zhifeng Qin, Ke Du,Zhenhai Chu,and Peiwu Qin，Current and Perspective Diagnostic Techniques for COVID-19，ACS Infect. Dis. 2020, 6, 1998−2016