做成像的小伙伴大抵都了解，在單分子成像中，信號往往是極弱的，如何從背景噪聲中pick出有效信號，是關鍵所在。為減小背景熒光（來自細胞的自發熒光等等）的影響，一般會采用“TIRF技術+科研級相機”進行成像。并較一般的成像應用，在靈敏度方面，單分子成像對相機的性能要求更為苛刻。

EMCCD相機在很長段時間里，都是單分子成像的心頭好。一騎絕塵的量子效率（QE）外加電子倍增技能BUFF，妥妥站穩C位。除了貴，別的沒什么毛病。

不過，隨著sCMOS技術的持續發展，sCMOS相機穩步地立起了自己的山頭。除擁有了更高的幀速、更多的像素數目、更高的分辨率，靈敏度/信噪比也得到了明顯的提升。

濱松sCMOS相機（ORCA-Flash 4.0等第二代系列產品）從2015年左右開始，就逐漸被用于了STORM等基于單分子成像的超分辨技術應用中，以獲得更高的幀速、分辨率。

濱松兩款高端sCMOS相機與CCD相機的性能比較

而背照式sCMOS技術的出現，讓sCMOS相機陣營又得到了一次飛躍。除了QE已達到與EMCCD相當的水平，受益于越來越低的噪聲，信噪比也獲得了進一步的提升。進而，對于單分子成像中信號較弱的場景，有了足夠的靈敏度。一方面，成像質量幾乎達到了媲美EMCCD的程度；一方面，價格較其還肉眼可見的成倍降低。

這性價比，就說，香不香吧！

圖源：bilibili.com

拿濱松2020年發布的首款背照式sCMOS相機ORCA-FusionBT來看。530萬像素（2304x2304），配合6.5μm的像素尺寸，提供了出色分辨率；信噪比（SNR）方面，兩個關鍵影響因素也做到了十分優秀的水平：QE高達95%，讀出噪聲低至0.7erms。

下面兩個案例，可以看到這臺背照式sCMOS在單分子成像中的優秀表現，特別是與EMCCD的成像對比：

案例 1

YFP標記的膜蛋白單分子TIRF成像

可見濱松ORCA-FusionBT sCMOS相機與EMCCD相機的成像效果對比。（受視頻網站上傳限制影響，圖像質量有部分折損，如需觀看原視頻，請在留言區留言。）

 

案例 2

ORCA-FusionBT sCMOS相機的單分子成像案例

熒光探針為TagRFP，此案例采用了雙色成像。

看到上面的成像效果，大家也就能體會到，單分子成像在相機選擇上的“移情別戀”，也是必然的了。

而在第二個案例中，我們看到，該實驗采用了雙色成像。單分子成像經常與FRET技術聯用，用于在單分子層面研究分子的構造變化（如蛋白質分子domain之間的距離變化等等）。

由于FRET技術需要對兩個波長同時監測采像，所以一般會在相機和顯微鏡之間加裝雙色分光器，通過二向色鏡/濾光片按照波長將信號分開，并分別成像。

針對這樣的需求，濱松還可供“相機+雙色分光附件”的雙色同步成像方案。方案可分為單相機方案與雙相機方案兩種，前者成本較低，后者則有更大的視野范圍以及更多擴展功能（如物鏡后焦面成像、PSF修飾等）。

濱松雙色分光附件W-View GEMINI系列

使用這套的雙色成像方案的單分子FRET成像案例，可以參閱The bright future of single-molecule fluorescence imaging, Curr Opin Chem Biol. (2014) 20:103-111這篇文獻。其中，作者采用濱松sCMOS相機與W-View GEMINI雙色分光器配合，得到了最高2ms時間分辨率的單分子FRET成像，分析了核糖體pre-translation complex的動力學結構變化。

Ok~單分子成像此次就聊到這里。而關于剛剛提到的單相機雙色同步成像、雙相機雙色同步成像這兩套方案，咱們就在下一期推文中，再為大家做詳細介紹啦~歡迎關注~