表觀遺傳相關的研究近年來也是一大研究熱點，我們知道的表觀遺傳修飾有組蛋白修飾，DNA甲基化，RNA甲基化等等。之前的推文也有專門介紹RNA甲基化相關的研究現狀和優勢http://www.bio-review.com/m6a-rna/，以及相關的產品推薦http://www.bio-review.com/rna-methylation-studies/。我們力薦的m6A檢測試劑盒p-9005也因其獨特的優勢和性能被廣大研究者偏愛，也是如今熱賣的產品，而今天小編就給大家復盤一下關于p-9005 檢測m6A甲基化相關的疑難雜癥和治療方法。

 

 

       一、 相關概念

 

       RNA甲基化是RNA的可逆翻譯后修飾，其表觀遺傳地影響許多生物過程。它發生在不同的RNA中，包括tRNA，rRNA，mRNA，tmRNA，snRNA，snoRNA，miRNA和病毒RNA。不同的RNA-甲基轉移酶具備相應的催化策略，用于RNA甲基化。

 

       6-甲基腺嘌呤（m6A）是在存在于真核生物的RNA分子中最常見的和豐富的甲基化修飾和占所有RNA甲基化的80％以上。它可以被稱為“第五RNA堿基”并且在調節胚胎發育和細胞命運中具有廣泛的作用。

 

       而我們推薦的p-9005產品是Epigentek公司的力薦產品，Epigentek集團公司是全球領先的創新技術和表觀遺傳學相關研究產品的開發商和供應商，專門做表觀遺傳方面產品，可以說在表觀遺傳方面，他們是專家。

 

       二、 p-9005產品性能和優勢

 

       性能：EpiQuik™m6A RNA甲基化定量試劑盒（比色）是一整套優化的緩沖液和試劑，用于比色定量RNA中的N6-甲基腺苷（m6A或6mA）。它適用于使用從任何物種（例如哺乳動物，植物，真菌，細菌和病毒）中分離的總RNA直接檢測m6A RNA甲基化狀態。

 

       EpiQuik™m6A RNA甲基化定量試劑盒優勢：

 

       1. 檢測物種多樣化，無物種限制；

       2.操作簡便快速，3~4h即可完成整個實驗

       3. 高靈敏度，其檢測極限可低至10 pg m6A

       4.獨特的結合溶液—可從mRNA和ncRNA（例如tRNA，rRNA和snRNA）中定量m6A

       5.高特異性

       6.帶孔微孔板格式使該測定靈活用于手動或高通量分析。

       7.簡單，可靠且一致的測定條件

 

 

       三、p-9005檢測的疑難雜癥和藥方

 

       1.病癥一：樣本

 

       對于這個試劑盒，很多人對與樣本方面有很多的疑問，雖然試劑說明書上說可適用任何物種的m6A檢測，但是同學們還是有各種各樣的問題：

     （1）RNA樣本類型

 

       處方：培養的細胞，新鮮和冷凍的組織，石蠟包埋的組織，血液，體驗等等樣本的總RNA，mRNA，tRNA，rRNA和snRNA均可適用該試劑盒。

 

     （2）RNA樣本提取方式

 

       處方：市面上銷售的試劑盒提取的均可，Trizol法可能是可以的，但是Trizol法提取的請確保提取后將RNA重新溶解在不含RNase的水中或合適的緩沖液（例如TE）中，并且RNA質量高且相對不含DNA。

 

     （3）RNA樣本符合要求的標準

 

       處方：OD 260/280 >1.9。260/230 > 1.7 【無DNA污染】

 

       2.病癥二: 對照

 

       關于試劑盒中的對照方面，也是有很多同學問詢。

 

     （1）陽性對照怎么設置

 

       對于第一次上手做這個實驗的同學們或許都會有些疑惑，陽性對照難道不都是要做標準曲線的嗎？不然怎么對照和計算呢？

 

       處方：其實，這個試劑盒是可以根據實驗需要進行選擇做單點對照（0.5ng/ml）還是做標準曲線（0.02~1ng/ml）。建議做復孔喲。

 

     （2）陽性對照信號太弱

 

       處方：【1】添加至孔中的PC量不足，確保加入足夠量的PC；【2】標準液未進行最佳稀釋，并充分混合；【3】確保PC的保存方式是按照說明書進行保存的，一定要保存在指定條件下喲，【4】在使用的時候，要注意稀釋后放置在冰上，保證有效成分不被講解。

 

     （3）陰性對照背景值太高

 

       處方：【1】可能沒有洗干凈，按照說明書進行清洗；【2】被PC或者樣本污染了，切記要換槍頭加樣；【3】孵育時間太長，按照說明書進行操作1~10min，最長也不能超過2h；【4】顯色時間過長，可適當縮減顯色時間。

 

    （4）樣本值太低或者沒信號

 

      處方：

 

      【1】可能是因為沒有加入足夠量的RNA。廠家推薦的樣本輸入量為100ng~300ng，200ng為最佳，但是這又不是絕對的噢，同學們可根據自己的樣本做相應的調整尤其在信號偏弱的情況下，可適當上調RNA的輸入量。

 

     【2】可能是因為產品本身m6A的含量就很低。

 

     【3】可能是樣本的純度不夠，有DNA或者其他的污染，或者RNA發生了降解，這些都可能造成低信號。

 

      【4】mRNA樣本的話，可能因為片段太小（<80 nts）,也會導致低信號。

 

       3.病癥三：數據分析

 

     （1）如何計算標曲

 

       處方：線性回歸，二階多項式，四參數對數回歸都可以。

 

 

    （2）不同輸入量檢測出來的數據是否可一同進行數據分析?

 

       處方：是可以的，但是要注意計算的時候要以不同的數據進行。比如你第一次的樣本輸入量是200ng，計算公式帶入的值為200；第二次樣本輸入量是300ng，計算公式帶入的值必須為300.

 

     （3）什么情況下的樣本OD值被認為是可用的？

 

       處方：只要樣品的OD高于NC的數值，該數據仍可用于計算m6A水平。

 

     （4）重復孔之間差異較大怎么計算？

 

       處方：對于重復孔之間差異較大，我們若是重復孔3個以上的話，我們一般會選擇舍棄其中差異特別特別大的一個值后再進行計算，但是只有2個孔的話，該怎么辦呢？這個時候我們不能隨便舍棄任何一個孔的值，同樣也沒有辦法提供相關的建議。但是需要注意：p-9005比色測定的%CV約為15%。

 

       4.病癥四：稀釋

 

     （1）需要稀釋的試劑組分如何稀釋？

 

       處方：按照說明書上給的配制比例進行稀釋，用TE buffer稀釋，建議即用即配，計算好所需的量再進行稀釋配制。

 

     （2）為什么有些組分稀釋后需要放置在冰上？

 

       處方：使用前應將稀釋的成分（例如PC標準品）放在冰上，以最大程度地減少試劑降解并保持試劑完整性。

 

     （3）稀釋液必須是TE嗎？可以替換成DEPC水或者無RNAase的水嗎？

 

       處方：可以使用DEPC水替代TE buffer，無RNAase的水也可以。

 

       5.其他

 

      （1）所有組分需要放置在室溫條件下回溫嗎？

 

       處方：對于產品組份中的Wash buffer，保存在低溫下可能會有鹽離子等沉淀，在使用前需要將其拿至室溫進行回溫，沉淀即可溶解，這樣可進行正常的實驗。

 

     （2）如何減少復孔間差異？

 

       處方：

 

       【1】在板中垂直而不是水平地加載復制樣品，因為這可以確保同時添加溶液以復制孔，并有助于最小化復制差異。

 

       【2】確保從孔中完全去除洗滌緩沖液，因為任何殘留的緩沖液都會增加背景信號和重復變異性，尤其是在敏感的ELISA中（例如用于甲基化檢測的ELISA）。

 

       【3】使用手動移液器代替典型的板輕拂/傾倒方法，以確保完全去除緩沖液并最大程度減少孔間污染。

 

       （3）有相關的參考文獻嗎？

       

       說道參考文獻，不僅有，而且非常多，還是處于實時更新的狀態，日期都非常的新（https://www.epigentek.com/catalog/epiquik-m6a-rna-methylation-quantification-kit-colorimetric-p-3646.html）：

 

       Tsuruta K. et. al. et. al. (September 2020). RNA N6-methyladenosine demethylase FTO regulates PD-L1 expression in colon cancer cellsBiochemical and Biophysical Research Communications. 530(1)

       Chen S et. al. (August 2020). WTAP promotes osteosarcoma tumorigenesis by repressing HMBOX1 expression in an m⁶A-dependent manner.Cell Death Dis. 11(8):659.

       Xu Y et. al. (August 2020). The FTO/miR-181b-3p/ARL5B signaling pathway regulates cell migration and invasion in breast cancer.Cancer Commun (Lond).

       Du J. et. al. et. al. (August 2020). N 6-Adenosine Methylation of Socs1 mRNA is Required to Sustain the Negative Feedback Control of Macrophage ActivationDevelopmental Cell.

       Zhang S et. al. (August 2020). Pregnancy carbon black nanoparticles exposure-induced neurobehavioral deficits are associated with m6A modification in offspring.

       Yang Z. et. al. et. al. (August 2020). RNA N6-Methyladenosine Reader IGF2BP3 Regulates Cell Cycle and Angiogenesis in Colon CancerGeneral Surgery.

       Zhu S et. al. (July 2020). Dexmedetomidine Suppressed the Biological Behavior of HK-2 Cells Treated with LPS by Down-Regulating ALKBH5.

       Jian D et. al. (July 2020). METTL14 aggravates endothelial inflammation and atherosclerosis by increasing FOXO1 N6-methyladeosine modifications.10(20):8939-8956.

 

       最后，溫馨提示：這個產品p-9005是有配套的中文說明書的，但是還請各位同學們拿到產品后，認真閱讀英文說明書喔，英文說明書為主，中文說明書為輔。

 

       以上就是小編整理的同學們常問的有關這個試劑盒的問題，各位同學若是有以上問題，可以借鑒喲~~

 

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