熒光，在生物實驗領域是一種很常見的工具，在實驗室應用方便且用途廣泛，無論是定性還是定量，計數(shù)還是成像，熒光相關(guān)實驗都能滿足需求。一臺操作便捷、清晰跟手的熒光顯微鏡往往比高端儀器贏得的Respect更多。熒光可以為細胞實驗做些什么？它的工作原理又是什么？一起來看！

一、什么是熒光
熒光是激發(fā)態(tài)分子不通過內(nèi)部轉(zhuǎn)換方式消耗能量回到基態(tài)，而是釋放出相應較低能量的光量子。

熒光物質(zhì)都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。不同熒光物質(zhì)有其最敏感而有效的激發(fā)波長，因而選擇合適的激發(fā)/發(fā)射光譜以獲得最佳的結(jié)果，是實驗中首要考慮的問題。在研究中常見的熒光相關(guān)參數(shù)都是相對應的，比如AO-DNA(500/526)、AO-RNA(460/650)、PI(535/615)、DAPI(359/461)、FITC(493/517)以及GFP(498/516)等。
 

二、熒光在細胞實驗中的應用

• 熒光染色計數(shù)

細胞實驗中，熒光的應用頻率可以說是最高的，只要涉及有關(guān)量的細胞實驗，就需要細胞計數(shù)。常規(guī)的活細胞計數(shù)法，推薦使用臺盼藍染色。但在培養(yǎng)原代細胞或分離PBMC時，殘留的RBC被臺盼藍拒染，無核細胞的干擾會影響整體的結(jié)果判定。而AO/PI染色計數(shù)便能解決這一問題！

AO具有膜通透性，可以通過完整細胞膜，使核DNA和RNA染色，同時在凋亡細胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的凋亡小體，AO使其染上黃綠色熒光，壞死的細胞黃熒光減弱甚至消失，呈現(xiàn)細胞核碎裂點狀大小不一、質(zhì)密濃染。

PI無膜通透性，只能通過不完整的細胞膜，因此只能使所有死細胞的細胞核呈現(xiàn)紅色熒光。

AO/PI特異性染色可以準確區(qū)分死活細胞，此外實驗室常用DAPI進行染核。DAPI是一種能與DNA強力結(jié)合的熒光染料，結(jié)合到雙鏈DNA上的熒光強度提高約20倍。在實驗過程中，固定細胞后導致細胞膜通透性增加，再加上DAPI的強結(jié)合性，便可高敏感性顯示出基因表達的亞細胞情況，進行基因定位。

• 熒光蛋白

常見有綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（RFP）。

使用最多的就是GFP，通過基因工程將其轉(zhuǎn)入基因組持續(xù)表達。最早在北冰洋寒冰水域，維多利亞多管水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了GFP，后有三位科學家分別將其投入試驗研究，并進行熒光的加強改造，最終獲得了2008年的諾貝爾化學獎。

廣泛應用后，GFP在顯像技術(shù)、示蹤技術(shù)、報告基因等應用中大放異彩。由于其獨特的光信號轉(zhuǎn)到機制，研究者將具有信號轉(zhuǎn)導的分子識別點，結(jié)合到熒光蛋白分子上設計生物感受器。可檢測核酸、激素等多種分子的表達狀況，甚至還能檢測活體細胞中蛋白的構(gòu)象變化，具有較為廣闊的應用前景。

三、C100自動細胞計數(shù)儀熒光功能
實驗室在做真核細胞轉(zhuǎn)染時，一般都會將GFP連入質(zhì)粒，通過熒光的表達，再通過DAPI定位細胞核檢測轉(zhuǎn)染的效率。

效率又是如何計算的呢？粗略估算？手動計數(shù)？用流式細胞儀？費時費力不說，約儀器還麻煩。瑞沃德新款自動細胞計數(shù)儀C100熒光功能可快速準確計算結(jié)果細胞數(shù)量，為您的實驗保駕護航。
 

熒光展示圖

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