提到克隆、重組載體，就想到5字金言：分、切、連、轉、篩，“分”是指分離制備合格的待操作的DNA；“切”是指用序列特異的限制性內切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；“連”是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；“轉”是指通過轉染的方法將重組的DNA分子導入宿主細胞中進行復制和擴增；“篩”則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的克隆。實驗具體怎么做，細節大體是沒印象了，但是這5個字卻記得真真切切，都是血淚的教訓，現在說起來貌似很簡單，誰知道當初這5步歷經了多少次煉獄循環。

 

       沒錯，在過去數十年，用限制性內切酶產生黏性末端，在DNA連接酶的作用下，連接兩個甚至更多片段的克隆方法，是載體構建的經典方案。但是現如今我們再提到克隆的時候，遠遠不再只有傳統的限制酶克隆一種選擇。其中Gateway克隆技術作為一種可以快速、高效將DNA序列轉移到載體上的克隆方法已經流行開來。不要覺得Gateway克隆技術高深莫測，其實了解一下你就能懂。

 

       Gateway克隆方法是λ噬菌體感染細菌時發生的整合和切割重組反應的體外形式。在體內，噬菌體（attP）和細菌（attB）的附著位點發生重組反應，噬菌體整合到細菌基因組中，兩側為兩個新的重組位點（attL-left-和attR-right-）。在某些條件下，attL和attR位點可以重組，導致噬菌體從細菌染色體上切除并重新生成attP和attB位點。

 

 

       即Gateway技術依賴于下面描述的兩個反應：BP反應和LR反應，通過BP反應獲得入門克隆(有時候我們也說中間克隆)，再通過LR反應將目的DNA以正確的方向連接到各種目的載體上，形成不同的表達載體。GeneCopoeia提供的 EZShuttle™重組克隆體系應用E.coli和λ噬菌體特異位點的重組酶促體系使 DNA片段在載體間相互轉換，其原理與 Gateway克隆技術相同。

 

       BP反應-構建入門載體：

 

       通過PCR將attB位點添加到目的DAN序列兩側，形成attB-PCR產物。用attB-PCR產物或者含attB位點的供體質粒和含attP位點的質粒發生重組生成入門克隆。

 

 

貨號	名稱	說明
RCBM-1002-020	EZRecombinase™ BP Cloning Kit (20 rxn)	Catalyzes attB x attP cloning（催化BP反應）
RCBM-1002-100	EZRecombinase™ BP Cloning Kit (100 rxn)	Catalyzes attB x attP cloning（催化BP反應）

       LR反應-構建表達載體：

 

       制作表達載體時，選擇適合的目標載體非常重要。這種選擇取決于許多因素，如宿主類型，所需的表達水平和實驗目的。選定的attR表達載體與attL-入門載體重組以產生表達載體。

 

 

       
       除了可以提供載體構建的BP Mix和LR Mix，GeneCopoeia還可提供40,000多種人和小鼠不同載體的即用型ORF表達克隆（可直接用于體內或體外不同宿主或表達系統的蛋白表達，省卻克隆構建步驟），以及20,000種人和15,000小鼠Gateway PLUS入門克隆（還需要進行亞克隆，將ORF序列轉移到表達克隆中）。你的基因我承包，不管你是需要構建好的表達克隆，還是入門克隆，不要猶豫，請聯系艾美捷科技，全方位科研需求的表達系統以及眾多的融合標簽可以滿足您的花樣需求

 

       全方位科研需求的表達系統

 

       
       眾多的融合標簽

 

熒光蛋白標簽	eGFP、eYFP、eCFP、mCherry
多功能標簽	HaloTag®、AviTag™、SNAP- Tag™
促溶解度標簽	His、Trx、SUMO、GST、MBP
抗體免疫共沉淀標簽	HA、Flag、cMyc

 

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