在之前發(fā)表的文章《實時熒光定量PCR檢測方法，你選對了嗎?》中提到，實時熒光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探針法、分子信標、熒光共振能量傳遞(FRET)和LUX Primers等。那么應用最為廣泛的則是SYBR Green染料法和TaqMan探針法，兩者各有所長。今天，先給大家介紹TaqMan探針法，它優(yōu)秀在哪里？

TaqMan 探針法

最關鍵的Taqman探針，是一條與靶序列特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，其能夠結(jié)合到正反向引物結(jié)合區(qū)域的中間部位，隨著PCR反應的進行，DNA聚合酶在延伸到探針位置時會將其水解，從而釋放熒光基團，擴增產(chǎn)物產(chǎn)生信號。

TaqMan探針法的優(yōu)勢

☑  高特異性，只有在探針和靶標基因之間發(fā)生特異性的水解，才會生成熒光信號。

☑  多重分析，可選擇不同的報告基因染料標記探針，在一個反應管內(nèi)擴增并檢測多個不同的序列。

☑  無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

探針序列的設計原則

1. TaqMan探針的長度最好不超過30bp。理想情況下，有15bp可獲得最佳特異性；

2. Tm值在67℃-72℃之間，確保探針的Tm值比引物的高5-10℃，在退火過程中優(yōu)先結(jié)合到模板上；

3. 探針序列的GC含量在20％至80％之間，避免多個重復的堿基出現(xiàn)，尤其要避免4個或超過4個的G堿基；

4. 探針盡量避免出現(xiàn)二聚體或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以保證足夠高的模板結(jié)合效率；

5. 探針5’端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團相連時，G也可以淬滅FAM基團所發(fā)出的熒光信號，從而導致假陰性的出現(xiàn)。

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如何選擇熒光基團和淬滅基團

修飾基團的選擇是探針法的重要環(huán)節(jié)，那么我們需要注意以下幾項：

1. 根據(jù)熒光定量PCR儀熒光通道，選擇適配的熒光基團，優(yōu)先選擇常用的熒光基團，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根據(jù)熒光基團類型選擇淬滅基團。早期的淬滅基團TAMRA，自身會發(fā)出熒光信號，干擾檢測結(jié)果，后續(xù)慢慢地被其他淬滅基團替代。目前淬滅基團最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 進行多重qPCR檢測時，每個通道要選擇不同的熒光基團，且避免各標記基團的激發(fā)和發(fā)射波長重疊，出現(xiàn)熒光干擾的情況。

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