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如何選擇合適的液相色譜分離模式

瀏覽次數:3784 發布日期:2020-6-5  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
自 1903 年,俄國植物學家米哈伊爾•茨維特發明色譜算起,色譜已走過 100 余年歷程。從最早正相色譜法,發展至今,諸多液相色譜分離模式:反相分離模式、親水分離模式、離子分離模式、體積排阻分離模式和親合分離模式等。因其具備多功能性和精確性,作為定性和定量的工具,液相色譜分析方法廣泛應用于各行各業,如藥物質量控制、食品營養物質和添加劑檢測、環境揮發性有機物檢測、法醫毒物司法鑒定、臨床質譜代謝物監控與高性能材料配方測定等。

了解和理解液相色譜分離模式,有助于液相色譜分析相關工作的開展和深入。
 

圖1.色譜鼻祖
米哈伊爾•茨維特,俄國植物學家
 
液相色譜分離機理,本質上是分析物在流動相與固定相之間作用力差異。對于樣品分析,需要綜合組分性質與分離目的,選擇合適的分離模式,便于獲取最佳分析結果。對于分離模式,簡介如下:
1.正相分離模式(Normal Phase
茨維特發明色譜的植物色素分離實驗,即采用正相分離模式。
機理:組分在極性固定相上的吸附/解吸附過程。
正相之意源自固定相極性大于流動相極性。
固定相以硅膠/氧化鋁居多;流動相包括正己烷、石油醚、二氯甲烷、異丙醇等非極性和弱極性溶劑。
適合非極性與弱極性化合物分離、異構體分析、復雜樣本分級以及特殊組分凈化等。
正相分離模式下容易在極性填料表面產生死吸附,導致較差的重現性;目前主要用于手性拆分和制備色譜。

如脂溶性維生素D2分析與維生素D組分凈化(GB 5009.82-2016 第四法食品中維生素D的測定):


圖2.維生素D2純度分析-正相分離模式
 
2.反相分離模式(Reversed Phase
機理:組分在疏水固定相與極性流動相之間分配差異(疏水相互作用)。
反相之意源自固定相極性小于流動相極性。
反相分離模式因其分辨率高、平衡速度快等優勢,在所有液相分離模式中占據主要地位(約70%樣品分析采用反相分離模式)。
    
圖3.反相分離模式適用小分子、大分子和手性分子拆分
 
固定相以疏水功能基團(C18/C8)鍵合填料居多;流動相包括水相(純水與緩沖液)、甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃等極性和中等極性溶劑。
適合極性化合物(耐純水反相填料,在高比例水相條件下,可實現令人滿意的保留和基線分離)、中等極性、弱極性和部分非極性化合物分離分析。
注意:對于部分可離子化組分分析,可通過添加離子對試劑的
方式,進行反相分析。


圖4.磷酸氯喹系統性實驗譜圖
 
3.親水分離模式(HILIC
機理:組分在流動相與固定相表面富水層之間分配差異。
固定相以極性基團鍵合填料居多;流動相包括水相(純水與緩沖液)、甲醇、乙腈等極性與中等極性溶劑。
固定相與正相分離模式一致,流動相組成包含有機相和水相,故有含水正相的別稱。又因分離模式中作用力較多,國內色譜理論界大拿至今不認可其作為單獨分離模式劃分。
親水分離模式起步較晚,但因其適合極性化合物分離分析,隨著生命科學迅速發展,應用范圍逐步擴大,目前成為高極性化合物分析的重要手段。適用于極性化合物(如草甘膦、極性代謝物和糖鏈)、無機離子和親水肽段等。
圖5.親水分離模式下6種極性化合物分離譜圖
 
4. 其他分離模式
離子分離模式(Ion-Exchange),基于離子化合物與固定相離子化功能基團之間離子相互作用。適合離子化化合物的分析,如無機離子、氨基酸、有機酸、聚核苷酸和蛋白電荷異構體等。
注意:3價離子不適合用離子分離模式進行分析,因其與固定相作用力過強,出現不保留或強保留甚至不出峰的情況。
體積排阻分離模式(Size-Exclusion),利用不同分子量組分在填料內流經路徑差異,實現分離。適用于低聚物組成、高分子化合物分子量測定與分布分析等。近年來在抗體藥物單聚體與多聚體分析、PEG偶聯分析等方面表現出卓越性能。
注意:該分離模式對于小分子之間的分析,分辨率極低,即使組分分子量差異在5倍以上。
親合分離模式(Affinity),利用受體與配體之間可逆特異性結合(復雜作用力),實現分離。經典應用,即是利用Protein A與IgG的Fc區域之間的親合作用,將Protein A鍵合在填料上,實現IgG類蛋白藥物的純化和濃度滴定。
親合分離模式(Affinity),利用受體與配體之間可逆特異性結合(復雜作用力),實現分離。經典應用,即是利用Protein A與IgG的Fc區域之間的親合作用,將Protein A鍵合在填料上,實現IgG類蛋白藥物的純化和濃度滴定。
離子分離模式、體積排阻分離模式(凝膠過濾)與親合分離模式,流動相均為含鹽緩沖液,可保證蛋白活性,特別適用于生物制藥行業。
 
 
液相色譜分析中,會遇到各種樣品組分,充分考慮分子性質和分析目的等方面信息,選擇合適的分離模式。一般來講,
  • 對于小分子分析首選反相分離模式;
  • 對于極性化合物分析,可首選高比例水相條件下的反相分離模式,其次親水分離模式。
  • 對于大分子分析,可選擇的分離模式較多, 反相、離子、體積排阻、親合與疏水等。
  • 對于手性分子,尤其慎重選擇填料和分離模式。
色譜包括液相色譜是一門經驗科學,用心思考,善加總結,隨著時間的積累,會加深對色譜的理解,綜合考慮各方面因素,拿出最好的實驗方案。
發布者:默克生命科學
聯系電話:400-900-3055轉8
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