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01 細胞準備篇

問：組織消化選擇什么消化液，消化多長時間？

答：組織的消化液有兩種，一種是EDTA,另一種是膠原酶，EDTA適合消化空腔性器官，例如小腸和胃；膠原酶消化比較廣泛，一般會搭配DNA酶一起使用，基本適合所有組織的消化。不同組織消化時間差異比較大，從十幾分鐘到數時小時都有。

問：消化的溫度如何選擇？

答：EDTA消化可以在冰上進行，膠原酶的消化需要37℃，這樣酶的活性最高。

問：基質膠培養之前，如何篩出干性細胞？

答：如果是單細胞，并且已知干細胞的特異性標記，可以通過流式分選或者磁珠分選。

問：類器官的培養必須要細胞具有干性嗎？正常組織成熟體細胞可以做類器官培養嗎？

答：只有干細胞擴增來源的培養物才能稱之為類器官，因此干性是必要條件。正常組織的成熟體細胞中往往會有一部分成體干細胞（標志物為Lgr5，CD133等），這部分細胞可以進行類器官培養。

問：如何選擇構建類器官的來源細胞？

答：理論上所有類器官都可以選擇從ESC/IPSC來構建，部分類器官可以選擇從組織中分離成體干細胞來構建，成體干細胞來源的類器官其構建周期短，體外傳代次數多，相對而言構建成本低；根據實驗需求，如果要通過類器官模型來研究器官的發育，需要對起始細胞進行基因編輯，一般都是通過ESC/IPSC來構建類器官。

02 類器官培養篇

問：類器官培養需要多長時間？

答：如果選擇從ESC/IPSC來構建類器官，需要1-2月(甚至更長)才能構建成功，如果是選擇從成體干細胞來構建類器官，一般只需要1-2周就可構建成功。

問：基質膠如何重懸細胞？

答：用基質膠去混細胞時，可以直接用基質膠去重懸細胞；也可以用培養基：基質膠=1:1的比例稀釋后重懸細胞，但是不推薦更大比例稀釋基質膠，因為加入過多的培養基時，膠滴容易散開，整個重懸過程在冰上操作，重懸細胞時禁止產生氣泡。

問：不同孔板培養類器官培養所需的基質膠和培養基體積?

答：類器官常用24孔板進行培養，一般每孔種一個50μl的膠滴，加入500μl培養基覆蓋膠滴；6孔板每孔可以種多個50μl的膠滴，加入2ml培養基覆蓋膠滴；96孔板一般每孔種一個10μl的膠滴，加入200μl培養基覆蓋膠滴。

問：基質膠可否反復凍融？

答：基質膠不建議反復凍融，偶爾凍融一兩次沒問題，多次凍融會影響基質膠內蛋白活性，但是要注意，基質膠凝固后不建議再用了。

03 類器官傳代篇

問：類器官傳代時如何收獲類器官？如何將類器官分散開？

答：基質膠在4℃時會變得很軟，吹打后可將基質膠分散開。通過離心去除上清液里的基質膠，收集的類器官重懸后可通過機械力吹打進行解離；也可以選擇用Cell recovery solution來消化基質膠，使基質膠溶解，通過離心去除上清液里的基質膠，Cell recovery solution對細胞團消化作用不明顯，因此更多時候類器官傳代需要使用消化酶(包括胰酶)消化成單細胞或小細胞團。

問：類器官傳代一般怎么傳��？

答：先把基質膠消化掉，可以對類器官消化(消化酶處理)或不消化(機械力吹打)。傳代通常按照1:2、1:3、1:4甚至1:10的比例都有傳代成功的例子。

問：如果傳代，有沒有對前一代類器官數量的要求？

答：由于傳代過程中類器官會有損失，因此類器官傳代時對前一代理論上有一定的數量要求，如類器官數量較少、尺寸較小、活性較差等都會影響傳代培養效果。類器官傳代須在類器官數量較多，且細胞狀態較好時進行。傳代時酶解或吹打盡量輕柔以免損傷細胞。并且傳代操作時盡量避免反復操作以免造成較大的細胞損失。

04 腫瘤類器官篇

​問：腫瘤類器官的培養是否也會生成正常的類器官，是否會影響藥敏測試的結果？

答：腫瘤類器官來源即為腫瘤組織，即使存在部分正常細胞，也是腫瘤微環境的一部分，且正常細胞的干性、增殖能力弱于腫瘤細胞，因此類器官建立后其大部分細胞為腫瘤細胞，少數正常細胞基本不會影響藥敏測試。

問：培養腫瘤類器官需要原始腫瘤組織的大小是多少？活檢樣本量足夠嗎？

答：腫瘤類器官培養所需手術組織大概需要3顆黃豆大小以上，穿刺活檢樣本需要至少3針，內鏡活檢至少鉗取6顆以上。因腫瘤異質性較大，建議可以取腫瘤組織不同部位分別進行類器官培養。

問：腫瘤類器官培養后能否建系？

答：部分腫瘤類器官是具有長期培養和穩定傳代的能力的，這類類器官可用于建系，但不是所有類器官都可以建系。

05 類器官鑒定篇

問：如何去鑒定培養的類器官是否成功?

答：看類器官大小、結構以及是否具有特殊形態。一般初次培養，最好進行HE、免疫熒光、基因測序鑒定。