包納米蟲（Bona）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書

產品僅用于科研產品名稱:包納米蟲（Bona）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）

規格:48T 0.1PCR管/48T 0.2PCR管

技術服務內容：

實驗步驟包括RNA提取、反轉錄、PCR和瓊脂糖凝膠電泳，以軟件分析電泳條帶的灰度值（IOD值），通過與內參基因的灰度值比較，判斷目的mRNA的相對表達量。
 

使用方法:

一、樣品 RNA 的制備

1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意：可以選用本公司生產的一管式病毒 RNAout

2、或柱式病毒 RNAout。

二：RT（逆轉錄）反應合成 cDNA

1. 按下表配制 RT 反應體系（20 μL 體系）

2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。

3. 嚴格按順序加入 6μL RT Buffer（含 dNTP）和 2μL MMLV 逆轉錄酶（含 RI），

反應終體積為 20μL。

4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。

5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，丌需要純化。

三、操作方法
 
1樣本的處理（在樣本制備區進行）：

1.1、取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標出），做標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)

1.2、每管加入 600 L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 L，一份樣本換用一個吸頭，再加入 200 L 氯仿，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈，以免產生乳化層，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。

1.3、取與1.1 相同數量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 L 異丙醇（-20℃預冷）， 做標記。吸取1.2 各管中的上清液轉移至相應的管中，上清液應至少吸取 500L，不能吸出中間層，顛倒混勻。

1.4、于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 L 75％ 乙醇，顛倒洗滌。

1.5、于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。

1.6、4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。

1.7、加入 11 L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存備用。提取的 RNA 須在 2 h 內進行 PCR 擴增；若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取核酸】。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內進行 PCR 擴增；若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內

實驗注意事項：

1）RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、細菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認實驗方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準確的名稱和ID號；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，*通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設計的引物來指示擴增的增加。運用該技術可以對DNA、RNA樣品進行定量（包括*定量和相對定量）和定性分析。

主要服務：DNA或RNA的*定量分析、基因表達差異分析、基因分型。

主要技術：引物設計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。