mRNA純化之后的文庫(kù)構(gòu)建通常有兩種思路，一種是先用oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，再進(jìn)行cDNA的片段化，另外一種則是先將mRNA打斷，再結(jié)合隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
 

1.先用oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，再進(jìn)行cDNA的片段化：此方法先得到長(zhǎng)片段的cDNA，反轉(zhuǎn)成雙鏈cDNA之后再利用DNA片段化的方法進(jìn)行片段化（酶切法或機(jī)械法），得到片段化dsDNA之后的建庫(kù)方法與DNA建庫(kù)方法完全一致。
 

2.先將mRNA打斷，再結(jié)合隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：此方法中的mRNA打斷方法包括堿處理法、金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法、酶（RNaseIII）處理法，mRNA片段化之后應(yīng)立即進(jìn)行一鏈cDNA合成，因?yàn)閙RNA在該體系下非常容易降解。選擇金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法打斷時(shí)需根據(jù)需要的文庫(kù)片段大小選擇合適的打斷溫度和時(shí)間。（一般設(shè)置為150-200bp 94°C，15 min； 200-300bp 94°C，10 min； 250-550 bp 94°C，5 min）

先針對(duì)mRNA進(jìn)行打斷再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得測(cè)序reads主要是針對(duì)基因本體的；若先反轉(zhuǎn)錄，尤其是結(jié)合oligo(dT)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得的測(cè)reads對(duì)轉(zhuǎn)錄本3'端具有比較強(qiáng)的偏好性，所以在mRNA-Seq中建議采用先對(duì)mRNA打斷再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的文庫(kù)構(gòu)建方法。