用EnSight™多模式檢測儀快速高效判斷病毒活性

瀏覽次數：3056　發布日期：2020-2-13　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

快速高效判斷病毒活性，何懼“疫”軍突起

農歷庚子年春節，“疫”軍突起，新型冠狀病毒（2019-nCoV）肆虐中華大地，全國上下正在面臨一場疫情阻擊戰。醫務工作者日以繼夜救治病患，科研人員加班加點投入到抗擊新冠病毒的相關研究中。

在病毒學研究中，病毒空斑實驗(virus plaque assay)將各稀釋度的病毒液接種到單層細胞培養環境中，吸附2小時后，在單層細胞上覆以瓊脂糖，病毒感染細胞并在細胞中增殖，使細胞破裂死亡。由于固體介質的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細胞向四周擴展。經過幾個增殖周期，便形成一個局限性病變細胞區，即病毒空斑。理論上，當病毒液充分稀釋后，獲得的每個空斑均源于最初感染細胞的一個病毒顆粒。空斑實驗是病毒滴定，篩選病毒突變株，檢測病毒抗體和抗病毒藥物研究的常規手段。區別于傳統的只檢測病毒顆粒的PCR和免疫熒光方法，病毒空斑實驗檢測有活性的感染性病毒顆粒，即空斑形成數(PFU)。

目前，病毒空斑實驗主要還是通過人工計數的方式在6孔，12孔或24孔板里實現。這樣的操作速度慢，主觀因素大，出錯率高；尤其當病毒活性比較高時，很難準確統計出空斑數。

相比之下，利用成像配合自動計數的方法可以提高病毒空斑的檢測通量，提升計數的準確性。如下圖所示，用AlexaFluor™ 488染色的病毒進行空斑實驗，在病毒空斑形成后通過明場成像和熒光成像，可以看到感染后病毒引起宿主細胞的結構改變，也稱為細胞病變效應(CPE)。這類效應可能是或者細胞裂解導致單層（溶斑）出現孔洞(A)，也可能是形態改變如細胞脫離（非溶斑）(B)。

利用模塊化的分析算法，計算機可以非常準確地判斷出這兩種細胞病變狀態。如圖C中，紅色標注的是溶斑空洞，而藍色的則是非溶斑的細胞脫離。

為了驗證計算機分析的準確性，研究人員進行了人工計數和計算機分析的比對實驗。將病毒按不同倍數進行稀釋，進行空斑實驗。實驗完成后，由3名分析人員進行人工計數，同時利用EnSight™多模式檢測儀進行成像和空斑計數分析（下圖）。

實驗結果顯示：人工計數和自動圖像分析都具有非常好的線性回歸，其R2值非常相似。但是當病毒稀釋倍數很低（病毒濃度高）的時候，人工計數就很難實現了，如下圖中的1:20和1:10兩個病毒濃度點（圖D）。

從空斑計數結果看（圖E），第一次實驗在人工可計數的病毒濃度下，計算機分析和人工計數值基本一值；但第二次實驗中，在1:160和1:640兩個病毒濃度下，2號分析人員明顯高估了空斑的個數。這也說明人工計數存在一定的主觀性，具有計數值偏離真實值的風險。

以上實驗是使用珀金埃爾默的EnSight™多模式檢測系統完成的。結果表明成像自動分析可以顯著提升病毒空斑實驗的通量以及實驗結果的準確性和穩定性。

珀金埃爾默公司的EnSight™多模式檢測儀是一款集傳統酶標技術和高速微孔成像于一體的系統。EnSight™成像模塊專為高速高效的細胞成像而設計，采用先進的sCMOS相機以降低信號背景噪音，激光自動聚焦以快速成像，固態光源 (LED) 以進行短時照明；配備高內涵(HCS)圖像分析內核的軟件Kaleido™，使圖像數據準確地轉化成數字信息。同時，EnSight™的Alpha和TR-FRET等模塊，可以在成像的同時檢測同一樣品中其他生化指標，讓研究變得多維度，讓科研人員對實驗結果有更好的把握。