RNA作為以DNA單鏈為模板的遺傳信息載體，其編輯相比DNA編輯而言，由于不會永久改變基因組，因此在安全性上有著不言而喻的優(yōu)勢。然而相對于DNA編輯，靶向RNA的編輯還沒完全被大眾熟悉，其實從上個世紀(jì)90年代起，對RNA編輯的自然過程已有了較多的認(rèn)識。近年來也逐漸開始進(jìn)化成為真正的RNA“編輯器”，并且已進(jìn)入一個快速前進(jìn)的軌道，上一期已為大家介紹了自然狀態(tài)下RNA在翻譯前的調(diào)節(jié)過程及操作原理，本期具體看看這些神奇的RNA編輯工具。

 

DNA和RNA的編輯最新發(fā)展是基于對ADAR蛋白以及CRISPR技術(shù)相關(guān)的酶的研究。對這些酶的深入認(rèn)識為有效地操縱特定的分子特征以測試其功能開辟了新的機(jī)會。從整體上來劃分，我們可以把RNA編輯（操作）工具分為兩大類，其實也就是兩大類酶復(fù)合物。這兩類工具在不同的角度對RNA進(jìn)行“編輯”，大大拓寬了我們對RNA進(jìn)行操作的能力。

 

1.一種是RNA效應(yīng)元件，這些效應(yīng)元件主要是可以對RNA進(jìn)行識別，靶向與切割，這種“編輯”是一種較為寬泛意義上的編輯；

2.另一種可稱為單堿基RNA編輯器，這類編輯器主要依托于ADAR蛋白或ADAR蛋白的變體，可以在單個堿基尺度上完成RNA水平上的“A-to-I”或“C-to-U”，并且具有較強(qiáng)的單堿基突變型遺傳疾病的治療潛力。

 

RNA效應(yīng)元件的開發(fā)

 

如小編之前所說，RNA效應(yīng)元件可以對RNA進(jìn)行識別，靶向與切割。看到這幾個詞，大家或許很快就想到了我們以CRISPR/Cas為代表的基因編輯工具。確實，在CRISPR/Cas誕生之后，科學(xué)家們也在一直思考，是否可以將基于Cas蛋白結(jié)合DNA的一些特性與應(yīng)用轉(zhuǎn)移至RNA上。而正是在這樣的想法催生下，基于CRISPR的RNA效應(yīng)物誕生了。接下來就一起看看其中的代表吧。

 

1. RCas9

命名：RCas9，顧名思義，就是RNA靶向的Cas9（RNA-targeting Cas9）

研究團(tuán)隊：基因編輯技術(shù)研究的領(lǐng)軍人物Jennifer Doudna的團(tuán)隊于2014年開發(fā)得到 [1]

原理：利用Cas9可識別與結(jié)合PAM序列的原理，設(shè)計了一種被稱為PAMmers的PAM遞呈寡核苷酸，可以讓Cas9特異定向識別并結(jié)合到單鏈RNA(ssRNA)特異位點上并完成切割。如果將RCas9與一種蛋白質(zhì)翻譯起始因子連接到一起并靶向特異的mRNA，那么就還可以起到對這個蛋白翻譯水平的調(diào)節(jié)。

應(yīng)用：兩年后，Yeo實驗室與Jennifer合作，采用RCas9對ACTB、TFRC和CCNA2等內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了編輯，并對融合了熒光蛋白（如GFP）的Cas9進(jìn)行觀察，開發(fā)出了在活細(xì)胞內(nèi)追蹤RNA運(yùn)輸?shù)墓ぞ撸�在胞�?nèi)RNA研究上更進(jìn)了一步[2]。

圖1. RCas9原理示意圖

圖2. RCas9對活細(xì)胞中的RNA進(jìn)行示蹤

 

2. C2c2

命名：CRISPR/C2c2，亦稱Cas13a，是目前第二大類CRISPR/Cas系統(tǒng)中，唯一能夠切割RNA的蛋白（諸如Cas9，Cpf1，C2c1等均是RNA介導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶）；

研究團(tuán)隊：基因編輯領(lǐng)域的另一領(lǐng)軍人物張峰的團(tuán)隊開發(fā)出的RNA靶向元件[3]；

原理：C2c2會與成熟的crRNA形成復(fù)合物，在不借助tracrRNA的情況下與單鏈RNA結(jié)合，而crRNA則會與類似PAM序列的PFS片段結(jié)合，并對單鏈RNA進(jìn)行切割，從而降低相應(yīng)蛋白的表達(dá)；

應(yīng)用：作為一種siRNA的替代手段，做到可調(diào)節(jié)的基因“敲低”（knock down）。

圖3. C2c2系統(tǒng)示意圖

 

3. CIRTS

命名：CIRTS（CRISPR-Cas inspired RNA targeting system），一種基于CRISPR/Cas的RNA靶向系統(tǒng)；

研究團(tuán)隊：今年6月，由來自美國芝加哥大學(xué)的Bryan C. Dickinson研究團(tuán)隊提出[4]；

原理：CIRTS由4個核心組分構(gòu)成：1）一個RNA發(fā)夾結(jié)合蛋白（RNA hairpin binding protein），可以在gRNA的引導(dǎo)下與特異性的RNA結(jié)構(gòu)結(jié)合；2）一個gRNA，它的結(jié)構(gòu)可以與設(shè)計好的發(fā)夾結(jié)合蛋白相互作用，同時它的序列與靶RNA互補(bǔ)；3）一個單鏈結(jié)合蛋白（ssRNA binding protein），可以與gRNA序列非特異性的結(jié)合，對gRNA起到穩(wěn)定和保護(hù)作用；4）一個效應(yīng)蛋白（effector protein），比如核糖核酸酶或者表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，可以對目標(biāo)RNA起特定作用。

應(yīng)用：CIRTS的復(fù)合物（如：ORF5-TBP6.7-Pin nuclease）對RNA的切割能力與Cas13幾乎沒有差別，而且可以模塊化。由于它的尺寸小（2.7kb），因而可以用AAV有效裝載。組分完全來源于人類蛋白，因而可以避免機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，為基因治療提供了新的工具。

圖4. CIRTS原理示意圖

 

 

單堿基RNA編輯器

 

 

顧名思義，單堿基RNA編輯器便是在RNA水平進(jìn)行單堿基突變矯正的工具，在DNA尺度上，ABE工具可以完美起到“A-to-G”的變化，但是在DNA尺度上，也有這樣神奇的RNA“ABE”。與我們熟知的ABE與CBE相比，它又有哪些不同呢？

 

1. ADAR融合蛋白進(jìn)行A-to-I編輯

ADAR蛋白（adenosine deaminase acting on RNA）的作用下發(fā)生的A-to-I。雙鏈RNA本就可以作為ADAR編輯的底物，而且在許多RNA靶向效應(yīng)物出現(xiàn)后，科學(xué)家們便也開始嘗試，是否可以將ADAR或ADAR核心脫氨結(jié)構(gòu)域與這些RNA靶向效應(yīng)物結(jié)合，從而實現(xiàn)在RNA上完成A-to-I（形式上等同于A-to-G）的編輯呢？

 

研究進(jìn)展：德國圖賓根大學(xué)的Thorsten Stafforst團(tuán)隊和波多黎各大學(xué)的Rosenthal團(tuán)隊：將ADAR的核心脫氨酶結(jié)構(gòu)域與SNAP-tag[5]或λN肽[6]結(jié)合，利用gRNA將復(fù)合物（如SNAP-ADAR）攜帶至靶向編輯位點（與gRNA形成雙鏈區(qū)域）進(jìn)行編輯，成功實現(xiàn)了靶位點A-to-I的轉(zhuǎn)換。

圖5. ADAR融合SNAP-tag或λN肽進(jìn)行A-to-I編輯

 

張峰團(tuán)隊：在Cas13系統(tǒng)出現(xiàn)后，張峰也將ADAR脫氨酶結(jié)構(gòu)域與dCas13b融合，開發(fā)出基于Cas13系統(tǒng)的A-to-I編輯工具：REPEIR（RNA Editing for Programmable A to I Replacement）[7]。

圖6. REPEIR原理示意圖

 

2. 利用內(nèi)源性ADAR進(jìn)行A-to-I編輯

雖然這樣的融合蛋白在RNA的A-to-I編輯上展現(xiàn)出了良好效果，但是仍然存在著幾大問題：

1. 蛋白分子量過大，使得通過病毒載體進(jìn)行裝載及人體內(nèi)遞送十分困難；

2. 由于蛋白過表達(dá)可能引起潛在的脫靶效應(yīng)；

3. 外源蛋白表達(dá)有可能引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；

4. 機(jī)體內(nèi)的抗體有可能會和蛋白發(fā)生中和反應(yīng)從而導(dǎo)致編輯失敗。

 

在這樣的問題之下，科學(xué)家們在RNA編輯工具開發(fā)上也在嘗試進(jìn)行新的探索。今年的3篇Nature子刊給我們打開了RNA編輯的新思路：那就是利用內(nèi)源性ADAR來進(jìn)行RNA編輯。

 

研究進(jìn)展：

德國杜賓根大學(xué)的Stafforst團(tuán)隊：今年1月在Nature Biotechnology發(fā)文，提出了一種名為RSETORE（recruiting endogenous ADAR to specific transcripts for oligonucleotide-mediated RNA editing）的方法。RESTORE使用了一段化學(xué)合成的寡核苷酸（ASO）與靶序列進(jìn)行互補(bǔ)配對，并添加了與靶向GluR2 mRNA相似的R/G motif作為ADAR的招募域（可見上一期公眾號對ADAR蛋白原理的介紹），利用人體細(xì)胞中已經(jīng)存在的ADAR蛋白進(jìn)行RNA編輯[8]。與IFN-α結(jié)合，RESTORE的編輯效率甚至可達(dá)80%。在研究中，RESTORE高效修復(fù)了導(dǎo)致α1-抗胰蛋白酶缺乏的PiZZ突變，并有效編輯了信號因子活性開關(guān)STAT1中的重要位點磷酸酪氨酸701。

 

加州大學(xué)圣地亞哥分校的Mali博士：今年2月，在Nature Methods上再度驗證，只使用改造過的指導(dǎo)RNA，就可以與ADAR結(jié)合并且將它帶到正確RNA序列，并且在小鼠模型中修復(fù)了與肌營養(yǎng)不良癥和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥相關(guān)的突變[9]。

圖7. RESTORE原理示意圖

 

北京大學(xué)魏文勝課題組：今年7月，也在Nature Biotechnology上發(fā)文，提出了一種名為LEAPER（Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA）的方法，只需轉(zhuǎn)入一條特殊設(shè)計的RNA (arRNA, ADAR-recruiting RNA)，就能夠通過招募細(xì)胞內(nèi)源的ADAR1 蛋白對靶向基因轉(zhuǎn)錄本上特定的A產(chǎn)生高效精準(zhǔn)的編輯，并不需要引入任何外源效應(yīng)蛋白。LEAPER在疾病治療領(lǐng)域的作用也得到了充分驗證。比如LEAPER可以通過修復(fù)抑癌基因TP53中的致病突變來恢復(fù)p53突變體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。此外，在Hurler綜合征患者來源的原代細(xì)胞中，LEAPER能夠成功修復(fù)致病突變，并恢復(fù)細(xì)胞中的α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性。相比于需要進(jìn)行化學(xué)修飾的RESTORE，LEAPER可以通過穩(wěn)定表達(dá)的方式在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此適用于裝載至腺相關(guān)病毒 (AAV)、慢病毒等載體中，在遞送至機(jī)體后持續(xù)發(fā)揮功能[10]。

圖8. LEAPER原理示意圖

 

3. C-to-U的RNA編輯

雖然ADAR可以良好地完成A-to-I的RNA編輯，但是針對于C-to-U的RNA編輯，先前的科學(xué)家們還沒有找到較好的手段。

研究進(jìn)展：今年7月，張峰實驗室通過分子進(jìn)化的方法，使ADAR2酶具有了可以將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）的全新能力，與此同時，它原先將A轉(zhuǎn)化為I的功能依舊得到了保留。通過進(jìn)一步優(yōu)化，該工具的脫靶效應(yīng)也被良好地進(jìn)行控制。這個全新的C-to-U工具被命名為RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange），打開了一個新的RNA編輯世界的大門[11]。為了驗證該工具在疾病治療上的潛力，研究者們對編碼與阿爾茨海默病有關(guān)的風(fēng)險因子APOE4的RNA進(jìn)行了編輯。RESCUE系統(tǒng)成功地將APOE4 RNA中的2個堿基從C變成了U，從而轉(zhuǎn)換為了安全無害的APOE2。

圖9. RESCUE原理示意圖

 

看到這里，大家是否對RNA編輯產(chǎn)生一個新的認(rèn)識呢？這樣的工具不僅為RNA的研究開拓的新方向，而且為疾病的基因治療提供新的工具。當(dāng)然，除了遺傳性疾病之外，在很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程之中，也伴隨著RNA編輯的發(fā)生。那么下一期的公眾號，就讓我們一起了解一下RNA編輯與腫瘤吧！

 

參考文獻(xiàn)：

[1]O'Connell MR, Oakes BL, Sternberg SH, et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature, 2014, 516 (7530): 263-266.

[2]Nelles DA, Fang MY, O'Connell MR, et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell, 2016, 165 (2): 488-496.

[3]Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science, 2016, 353 (6299): aaf5573.

[4]Rauch S, He E, Srienc M, et al. Programmable RNA-Guided RNA Effector Proteins Built from Human Parts. Cell, 2019, 178 (1): 122-134.

[5]Stafforst T, Schneider MF. An RNA-deaminase conjugate selectively repairs point mutations. Angew Chem Int Ed Engl, 2012, 51 (44): 11166-11169.

[6]Montiel-Gonzalez MF, Vallecillo-Viejo I, Yudowski GA, et al. Correction of mutations within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by site-directed RNA editing. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110 (45): 18285-18290.

[7]Cox DBT, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science,  2017, 358 (6366): 1019-1027.

[8]Merkle T, Merz S, Reautschnig P, et al. Precise RNA editing by recruiting endogenous ADARs with antisense oligonucleotides. Nat Biotechnol, 2019, 37 (2): 133-138.

[9]Katrekar D, Chen G, Meluzzi D, et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nat Methods, 2019, 16 (3): 239-242.

[10]Qu L, Yi Z, Zhu S, et al. Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nat Biotechnol, 2019, 37 (9): 1059-1069.

[11]Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Franklin B, et al. A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing. Science, 2019, 365 (6451): 382-386.