近日，華山醫(yī)院關(guān)明教授團(tuán)隊(duì)在《Clinica Chimica Acta》雜志發(fā)表題為”Detection of BRAF V600E mutation in fine-needle aspiration fluid of papillary thyroid carcinoma by droplet digital PCR”的研究論文。在關(guān)明教授的指導(dǎo)下，中心實(shí)驗(yàn)室的許笑助理研究員首次通過(guò)微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）以甲狀腺乳頭狀癌（PTC）患者的細(xì)針穿刺（FNA）樣本為檢材，建立了精準(zhǔn)可靠、靈敏度高的BRAF V600E突變檢測(cè)方法。

PTC是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤，占甲狀腺癌的85%。目前，超聲引導(dǎo)下的FNA樣本病理檢查是診斷PTC的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，高達(dá)1/3的病例通過(guò)常規(guī)病理學(xué)檢查進(jìn)行確診時(shí)仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)，主要?dú)w結(jié)于FNA樣本中獲得的腫瘤細(xì)胞數(shù)量少且細(xì)胞質(zhì)量及單一性方面差異較大。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)核酸物質(zhì)的遺傳學(xué)改變成功克服了臨床PTC診斷的難點(diǎn)。目前，常見(jiàn)的檢測(cè)方法主要有免疫組化、ARMS法和測(cè)序法，但是這些檢測(cè)技術(shù)受靈敏度的限制無(wú)法有效實(shí)現(xiàn)FNA樣本中少量腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)，因此需要建立一種更為精準(zhǔn)和靈敏的方法用于PTC的早期診斷。

微滴式數(shù)字PCR是一種新型的核酸定量技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的精準(zhǔn)定量，與其它臨床檢測(cè)方法相比靈敏度更高、特異性更好。此外，在過(guò)去幾十年BRAF V600E突變已確定是最常見(jiàn)的與PTC的發(fā)生、發(fā)展及臨床病理特征密切相關(guān)的分子標(biāo)志物。因此，該研究基于ddPCR首次對(duì)FNA樣本的BRAF V600E突變檢測(cè)，同時(shí)與常規(guī)ARMS方法進(jìn)行比對(duì)，用于PTC臨床樣本的檢測(cè)。研究根據(jù)NCCN甲狀腺癌臨床實(shí)踐指南，收集并診斷了146例PTC患者、2例甲狀腺濾泡狀癌（FTC）和12例甲狀腺良性結(jié)節(jié)病例。采集FNA樣本，分別采用ddPCR和ARMS檢測(cè)其BRAFV600E突變。

研究結(jié)果顯示，ddPCR在檢測(cè)中具有良好的重復(fù)性（CV0.1%=22.82%，CV10%=4.85%）和極高的檢測(cè)靈敏度（最低1-2 copies/μL，0.01%）。在全部160例病例中，使用ddPCR共測(cè)得128例BRAF V600E突變，其中4例為ARMS陰性病例，3例為良性結(jié)節(jié)病例。由此可知，在FNA標(biāo)本的BRAF V600E突變檢測(cè)中，ddPCR的敏感度和準(zhǔn)確性表現(xiàn)優(yōu)異。在一些臨床樣本的檢測(cè)應(yīng)用中ddPCR優(yōu)于金標(biāo)準(zhǔn)的病理檢測(cè)及傳統(tǒng)的ARMS方法，詳見(jiàn)圖1。綜上所述，基于ddPCR的檢測(cè)方法能有效提高檢出率、避免誤檢、漏檢，適用于PTC的早期臨床診斷。
 

A. H&E staining of 2 FNA samples revealed tumor cells in Sample 01 but not Sample 02.

B. ARMS detected BRAF V600E mutation in Sample02 but not Sample 01.

C. ddPCR detected BRAF V600E mutation in both samples.

圖1.臨床樣本的病理學(xué)、ARMS及ddPCR檢測(cè)結(jié)果

該論文的合作方為交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，并列第一作者為來(lái)自仁濟(jì)醫(yī)院的馬硝惟，并列通訊作者為仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科李敏主任。本課題得到國(guó)家自然科學(xué)基金、上海市衛(wèi)生局及上海市市科委等的經(jīng)費(fèi)資助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.cca.2019.01.017