酶標記抗體或抗原


    酶標記的抗原或抗體稱為結合物（conjugate）。抗原由于化學結構不同，可用不同的方法與酶結合，如為蛋白質抗原，基本上可參考抗體酶標記的方法。制備抗體酶結合物的方法通常有以下幾種。


    1.戊二醛交聯法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可以使酶與蛋白質或其他抗原的氨基通過它而偶聯。戊二醛交聯可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。戊二醛一步法操作簡便、有效，而且重復性好。缺點是交聯時分子間的比例不嚴格，大小也不一，影響效果。制備HRP抗體結合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標抗體。此法的效率可高于一步法l0倍左右。


    2.過碘酸鹽氧化法：本法只用于HRP的交聯。該酶含18%碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質結合，形成摩爾比例結合的酶標結合物。有人認為此法為辣根過氧化物酶交聯有效的方法。但也有只認為由于所用試劑較為劇烈，各批實驗結果不易重復。

    按以上方法制備的結合物一般混有未結合的酶和抗體。理論上結合物中混有游離酶不影響ELISA中酶活性測定，因經過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因而減低結合到固相上的酶標抗體量。因此制備的結合物應予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法操作簡便，但效果不如用sephadexg-200凝膠過濾的好。


  3.標記抗體鑒定：通常采用棋盤滴定法進行篩選。