多能干細(xì)胞PSC培養(yǎng)傳代復(fù)蘇技巧

瀏覽次數(shù)：4582　發(fā)布日期：2019-8-30　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

提到多能干細(xì)胞（PSC）培養(yǎng)，
經(jīng)常會(huì)遇到諸如此類不省心的事兒
。。。。

那么關(guān)于PSC傳代培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇
及基質(zhì)使用
都有什么技巧和要點(diǎn)？
這次我們繼續(xù)就廣大用戶遇到的困難，
用心總結(jié)
快把你們的眼神轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)！
自由選擇板凳，沙發(fā)，還是躺床上漲姿勢(shì)
此外若仍有疑問(wèn)，歡迎大家積極發(fā)言！！！
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無(wú)血清培養(yǎng)基

PSC培養(yǎng)通常推薦使用無(wú)血清培養(yǎng)基，
比如，BI NutriStem® hPSC無(wú)血清培養(yǎng)基。
支持hESC及iPSC快速貼壁并大量增殖，bFGF和TGFβ因子濃度更低，不干擾細(xì)胞代謝，不刺激細(xì)胞分化。
并且適用于臨床，已獲得美國(guó)FDA二類原料藥證號(hào)，DMF NO：30984

hPSC傳代

何時(shí)開始傳代培養(yǎng)？
1. 滋養(yǎng)層細(xì)胞老化
2. 細(xì)胞集落太密或細(xì)胞停滯增長(zhǎng)
3. 細(xì)胞集落已經(jīng)有合并的現(xiàn)象
4. 細(xì)胞集落開始堆積或分化

完全培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
1. 凍存的 NutriStem^® hPSC XF在室溫或2-8℃解凍，避免反復(fù)凍融，解凍的培養(yǎng)基可以存儲(chǔ)2-8°C，2周內(nèi)使用完畢。
2. 如果需要較小的數(shù)量，以無(wú)菌技術(shù)配制成等份，避免反復(fù)凍融。
3. NutriStem^®hPSC XF使用前必須回溫至15°C-30°C，為確保培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，只需回溫所需的量，貯藏時(shí)避免照光。

如何做好傳代培養(yǎng)？
1. 以6孔板滋養(yǎng)層培養(yǎng)為例，吸除孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入1.0 ml膠原酶溶液。
2. 放置在37°C或室溫，直到細(xì)胞集落從孔板的邊緣開始松動(dòng)（孵育的時(shí)間，在細(xì)胞株和細(xì)胞聚落大小之間會(huì)有所不同）。一般孵育3分鐘后開始檢查細(xì)胞集落，勿孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，hPSC細(xì)胞對(duì)膠原酶比較敏感，容易從孔板脫落。
3. 吸去分離液，用2ml無(wú)菌培養(yǎng)基DMEM/F-12 (1:1)輕洗兩次。
4. 加入1ml培養(yǎng)基，用5ml移液管輕輕將脫落hPSC細(xì)胞從孔板內(nèi)吹打下來(lái)，謹(jǐn)慎吸出上清至離心管，不要吸到滋養(yǎng)層細(xì)胞。
5. 在室溫以800rpm離心3~5min。
6. 吸除上清，加入NutriStem^®hPSC XF培養(yǎng)基，用5ml移液管輕輕將細(xì)胞團(tuán)打散，將細(xì)胞接種至有滋養(yǎng)層細(xì)胞孔板中，加入2.5~3.0ml NutriStem^®hPSC XF培養(yǎng)基，放入37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
7.每天更換一次2.5~3.0ml新的NutriStem^®hPSC XF培養(yǎng)基

關(guān)于細(xì)胞傳代比例
保持細(xì)胞的傳代比率很重要，
生長(zhǎng)較慢的細(xì)胞按1：4傳代，生長(zhǎng)較快的按1：8傳代

基質(zhì)的使用

無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)，建議使用層粘連蛋白LN521。
在LN521上，hPSCs細(xì)胞以單細(xì)胞形式接種，生長(zhǎng)成為均質(zhì)的單細(xì)胞層，無(wú)自然分化，也無(wú)須使用凋亡抑制劑。
細(xì)胞約在4至6天內(nèi)達(dá)到融合，并擴(kuò)增10至25倍
周末也無(wú)須進(jìn)行換液

層粘連蛋白包被
層粘連蛋白涂層包被，包被濃度0.5-1μg/cm²
（一般包被 0.5μg/cm²），以下以6孔板為例：

1. 在2-8°C緩緩解凍層粘連蛋白（重組LN521）。
2. 用含鈣鎂的DPBS稀釋LN521至5ug/ml
3. 每孔加入2ml稀釋好的LN521。
4. 密封培養(yǎng)器皿（如使用parafilm^®膜）防止蒸發(fā)，在2-8°C孵育過(guò)夜，確保層粘連蛋白溶液均勻分布在表面。避免表面干燥，以免層粘連蛋白失活。

在LN521上培養(yǎng)hPSC細(xì)胞
1. 以6孔板滋養(yǎng)層培養(yǎng)為例，每孔加入適量DPBS （2ml/well 不含鈣離子和鎂離子)輕輕沖洗1次，每孔加入1.0ml重組胰酶-EDTA，覆蓋整個(gè)細(xì)胞表面，在37°C 作用 2~4min(勿在EDTA孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng))。
2. 加入4.0ml的1xSBTI ，中和重組胰酶-EDTA，并將細(xì)胞吹打下來(lái)。謹(jǐn)慎收集細(xì)胞懸液到離心管中, 200xg離心5min。
3. 離心后，棄上清液，用1.0ml完全培養(yǎng)基懸浮后，混勻細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)1:1混勻，計(jì)數(shù)細(xì)胞。
4. 將細(xì)胞接種至層粘連蛋白包被培養(yǎng)器皿中，加入3.0-4.0 ml培養(yǎng)基，10-20,000 /cm²細(xì)胞密度，培養(yǎng)約4-5天。
5. 在37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時(shí)內(nèi)不要移動(dòng)孔板(會(huì)促進(jìn)分裂后細(xì)胞分化）。每天更換一次新的NutriStem^®hPSC XF培養(yǎng)基，2.5~3.0ml。48小時(shí)后達(dá)到最佳培養(yǎng)密度，4-6天后，大多數(shù)細(xì)胞達(dá)到倍增10-25倍。

關(guān)于細(xì)胞凍存和復(fù)蘇，
我們已經(jīng)總結(jié)過(guò)，
BI教您如何做好細(xì)胞凍存與復(fù)蘇？
看過(guò)的童鞋可以再?gòu)?fù)習(xí)一遍，
看看是否真正掌握！

細(xì)胞凍存

若是貼壁細(xì)胞，請(qǐng)先將細(xì)胞消化下來(lái)；若是懸浮細(xì)胞，請(qǐng)直接按以下步驟進(jìn)行：
1. 以200-300g離心3分鐘，棄去上清，收集細(xì)胞。
2. 用BI無(wú)血清凍存液將細(xì)胞重懸（不需回溫），將細(xì)胞密度調(diào)整為3~5x10⁶cells/ml，添加到凍存管中（一般每管1ml）。
3. 建議將含有細(xì)胞懸液的凍存管放進(jìn)程序降溫盒或是保溫杯中，置于-80°C冰箱6小時(shí)以上或是過(guò)夜（或不需要程序降溫)。
4. 將凍存管迅速移到液罐氮中保存。
5. 凍存24小時(shí)后，建議檢測(cè)細(xì)胞存活率。

細(xì)胞復(fù)蘇
1. 將細(xì)胞凍存管由液罐氮中取出，置于室溫回溫，不用水浴溶解。此時(shí)可準(zhǔn)備新鮮培養(yǎng) 基、無(wú)菌15ml離心管、培養(yǎng)瓶等。
2. 在生物安全柜內(nèi)，直接以少量培養(yǎng)基反復(fù)沖融，使細(xì)胞團(tuán)塊化凍。
3. 先在15ml無(wú)菌離心管中加入5ml培養(yǎng)基，再將化凍的細(xì)胞懸液加入離心管中。以200~300g，3分鐘離心收集細(xì)胞。
4. 倒去上清液，重懸細(xì)胞，移到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。