1）膜蛋白的結構形成過程研究

成孔毒素（Pore-forming toxin, PFT）能在靶細胞膜上寡聚化形成穿膜通道, 破壞細胞膜結構并使其滲透性增強而導致細胞滲透性溶解。 PFT寡聚體在細胞膜上可以連接形成密排六方結構（hcp）。

Lysenin是來源于蚯蚓的一種PFT，可在鞘磷脂/膽固醇（SM/chol）雙層膜結構中寡聚化并形成hcp。實驗中，研究人員使用了日本RIBM的超高速視頻級原子力顯微鏡（HS-AFM），對SM/chol雙層膜結構中lysenin寡聚體組裝成hcp的動態過程進行了實時成像，發現了hcp結構形成的規律。

 

 

研究人員將lysenin與SM/chol雙層膜結構在云母為基底的環境下共同培養后使用HS-AFM進行成像。下圖顯示了lysenin寡聚體形成的hcp在膜結構上的分布。白色六邊形表示一個hcp單元，箭頭表示未完全形成的寡聚體。通過計算可以獲得Hcp單元的間距和寡聚體直徑等數據，與之前使用電鏡的研究獲得的數據一致。

 

 

通過HS-AFM還可以獲得lysenin寡聚體的三維圖像。對各個寡聚體的高度數據進行統計，可以發現高度分布主要為兩種，高度較低的寡聚體已經嵌入了膜結構中，并可能形成了核孔。

 

 

接下來研究人員對400×300nm區域內的SM/chol雙層膜結構上的lysenin組裝過程進行了動態成像。圖A展示了lysenin簇的形成并可以檢測簇的增長方向（圖B），最終組裝形成hcp結構。 

在黑色的云母基底上也能觀察到lysenin，分析雙層膜結構上和基底上的lysenin半徑大小可以得出，雙層膜結構上的lysenin形成了寡聚體進而組成hcp結構，而基底上的lysenin處于單體或不規則聚集形態，無法形成寡聚體，這也與之前的研究結果一致。

對視野內的lysenin簇如B圖進行劃分并進一步分析可以得出：

1. Lysenin形成單個簇后，在雙層膜上水平擴散，聚集排列形成hcp結構；

2. 新形成的簇會組成新的矩形排列（彩色矩形）或填充到已有的矩形排列的空缺處，有些已經形成的簇會在膜上擴散或分解；

3. 矩形排列的方向可變（如最上方紅色矩形）；

4. 絕大多數Lysenin簇在裝配開始就會聚集形成簇，而不是隨機分布在膜上。

 

 

HS-AFM還可以在更高的放大倍數下以更高速率成像，以實現對lysenin簇組裝成hcp結構的動態進行更詳細的檢測。

通過對結果的分析可以得出，大部分從外圍結合到hcp結構區域的簇會以平均0.45秒的時間分解，而已經形成hcp結構的則相對更加穩定，可能原因是內部的lysenin寡聚體相互之間具有更多的結合位點，更難以分解。

 

 

 

小結：高速AFM成像可用于lysenin形成hcp結構的動態過程的研究。lysenin簇于膜上形成，經過大量的分解\重組和擴散形成hcp結構，隨著膜上hcp數量的增多而趨向于穩定。同時，我們還可以獲得簇的高度信息，用于表征lysenin與膜的結合以及穿膜通道的形成。

 

 2）膜蛋白的結構形成機制研究

膜聯蛋白（Annexin）是于真核細胞的細胞質內普遍存在的一種蛋白，與多種細胞膜功能相關，如胞吞、胞吐以及離子轉運等。膜聯蛋白在鈣離子環境下可結合至磷脂，進行細胞膜修復等作用，但至今對于膜聯蛋白-鈣離子-磷脂三者的組裝與分解的動態過程的研究仍處于空白。

這項研究中，研究人員使用日本RIBM的超高速視頻級原子力顯微鏡（HS-AFM）引導了膜聯蛋白V（A5）的組裝與分解并進行成像，分析了過程中的蛋白結構，動力學和分子間相互作用。

研究人員首先將雙層脂膜加入含2mM鈣離子的緩沖液，再加入A5并用HS-AFM成像。可以觀察到A5三聚體在膜上形成了六邊形晶格結構（標記1），并在中間含有縱向高度更低的三聚體（標記2）或者空洞（標記3），這與先前使用其他AFM和電鏡的結果相一致。 

 

 

HS-AFM可以進行每秒幾十幀的更高速度的成像。對上圖中標記2的區域進行高速成像，三聚體依然保持了相似的尺寸和高度。在高速成像下，研究人員首次發現三聚體的方向會發生變化：向上（0°）和向下（60°）。此A5三聚體與其他形成了六邊形晶格結構的三聚體相比，分子間相互作用更弱，使其能夠改變方向。

 

 

 

傳統的AFM和電鏡獲得的圖像是時間或空間的平均圖像，無法記錄極短時間內的變化，因此難以發現三聚體方向的改變。通過HS-AFM的高速實時成像才發現并捕捉到了這一現象。

HS-AFM還可以與微流系統和激光等其他儀器結合，在實驗過程中對樣品和環境進行更多操作并實時成像，可以對兩種A5三聚體的組裝與分解進行更加深入、詳細的研究。

研究人員使用微流系統可向實驗環境加入EDTA,可以降低鈣離子含量，使三聚體形成的晶格結構分解，同時，通過精確控制的流量可以精準地計算出加入EDTA的含量進行定量分析；整合的高精度紫外激光，可以對鈣離子籠鎖化合物進行解籠鎖操作，使其在實驗過程中可以多次反復釋放鈣離子。

 

起初，我們可以清晰地觀察到晶格結構；277s時緩慢加入40mM EDTA后，晶格結構分解；441s時啟動紫外激光，解籠鎖發生釋放出鈣離子，晶格結構重新組裝；870s時關閉激光，晶格結構再次開始分解。

進一步提高放大倍數后進行高分辨率成像，可以發現加入EDTA后，非六邊形晶格的A5三聚體相對于形成了六邊形晶格結構的三聚體分解更快，對于鈣離子含量下降更加敏感。

 

 

小結：通過HS-AFM的高速、高分辨率成像以及與其他儀器的聯用，在體外構建了實時生化反應環境，在對蛋白結構直接成像的同時，發現了構成膜聯蛋白結構的兩種不同狀態的蛋白三聚體的差異，同時證明了鈣離子在蛋白組裝過程中的必要性。

3）膜蛋白的跨膜運動機制研究

谷氨酸鹽跨膜轉運蛋白（GltPh）的主要作用是通過跨膜轉運谷氨酸鹽，將突觸間隙的谷氨酸鹽濃度保持在興奮性毒性以下，防止神經元死亡導致神經系統疾病如癲癇、老年癡呆等。

GltPh如右圖所示，由一個固定在膜上的三聚體結構域（橙色）和一個轉運結構域（藍色）組成。在有鈉離子和谷氨酸的環境下，轉運結構域可移動至膜的對側來轉運谷氨酸鹽；在無基底的環境下，轉運結構域也可以跨膜移動。

之前，GltPh的直接動態成像很難實現，RIBM的超高速視頻級原子力顯微鏡（HS-AFM）攻克了這一難關，向我們展示了GltPh的跨膜升降運動。

 

 

實驗開始前，研究人員將GltPh純化后與脂類組成的囊泡整合成跨膜結構，并用HS-AFM觀察。

在無基底的環境下，GltPh的三聚體結構清晰可見。當每個轉運結構域暴露在胞外的部分朝向顯微鏡的探針，即處于上升（up）狀態，突出的部分形成了一個三角形，中間則形成空洞（t=57s）；每個轉運結構域也可朝向胞內（t=58s），此時處于下降（down）狀態。

 

 

環境中單獨加入鈉鹽時，GltPh處于上升狀態的平均時間為33s，這意味著GltPh僅結合Na+離子時跨膜運動受到抑制。

加入充足的鈉鹽和谷氨酸，使環境濃度達到飽和后，GltPh處于上升狀態的平均時間為 11.1 s，開始進行活躍的跨膜轉運活動。

以上的結果證實了，當Na+和谷氨酸同時存在或缺失時，GltPh的跨膜運動相對于僅有Na+時更加活躍，GltPh是Na+和谷氨酸的協同轉運載體。

 

 

 

 HS-AFM在進行高速成像的同時，保持了很高的空間分辨率，可以清晰地分辨三聚體的每一個結構域，使得我們可以對不同結構域運動之間的關系進行研究。

我們針對一個GltPh三聚體，通過視頻統計的數據計算了其處于不同狀態（結構域處于上升狀態的數量）的概率，結果與使用自由能公式計算出來的概率一致。

進一步對結構域運動的關系進行統計，可以得出三聚體的結構域之間運動是相互獨立的，這也直接驗證了之前的研究結果。

 

 

小結：使用HS-AFM獲得的高空間&時間分辨率的視頻級圖像，可以準確地反應生物大分子的運動狀態，用于精確定量研究。