隨著熒光檢測的普及，許多科研人員將western blot的檢測方法從化學發光轉到多重熒光。這是因為熒光檢測能夠實現多重western blot分析，每次能夠同時檢測幾個目標蛋白，而不再需要剝離和重新雜交。另外，熒光的好處在于動態范圍更寬、信號穩定性更好。

為了讓你的實驗過程能輕松+成功，深藍云生物研發部的專家們為我們帶來了一些熒光western blot的小貼士。
 

★ 熒光Western Blot基礎知識 ★

熒光western blot可以進行多重檢測并生成可定量的精準數據滿足期刊雜志對于數據發表的要求。熒光檢測解決了化學發光檢測所面臨的一些局限性，例如：數據的重現性，半定量，動態范圍等問題。所以熒光Western blot變得越來越流行。對于需要更復雜的信號線性分析和蛋白豐度相關性的研究人員來說，熒光方法是一個很好的選擇。 

一旦你決定使用熒光數字成像系統，下一步就是仔細考慮印跡試劑了。高品質，低熒光膜是熒光Western blotting的首選。也需要優化封閉液和漂洗液，提供更好的解決方案。小伙伴在從化學發光轉換到熒光檢測時遇到的最大問題之一是高背景。使用正確的膜，以及封閉液和漂洗液，將確保你開始正確的熒光western實驗。在轉印過程中，關鍵是要使用一種不會產生太多熱量的協議。高溫會導致背景升高，特別是在可見熒光檢測中。因此，在不產生過多熱量的緩沖液中，短時間內進行濕轉或半干轉是理想的選擇。

最后和最具挑戰性的試劑選擇是熒光二抗的選擇。幸運的是，隨著熒光檢測方法的日益普及，市場上有大量的商品化的熒光二抗可供選擇。在選擇抗體染料偶聯物之前，了解成像系統每個通道的激發波長和發射波長是很重要的。一旦了解了這些信息，您就可以選擇與您的系統最兼容的染料。

如何提高熒光western blot檢測效果

★  用滴定法測定一抗和二抗的原始濃度。

★  多重檢測之前，先分別對目的蛋白和內參進行優化。

★  一抗的使用濃度要高于傳統的化學發光的2-5X。二抗的濃度也需要增加，一般建議使用的初始稀釋度是1:5000。

★  使用低背景的PVDF 膜。NC 膜和一些PVDF 自發熒光較高， 引起高背景。

★  避免標記和染料本身產生的熒光。使用鉛筆標記印跡膜。例如溴酚藍和考馬斯亮藍都有自發熒光。

★  保持潔凈，在使用前對托盤等設備進行清洗，戴手套處理凝膠，用鑷子處理膜。

★  熒光抗體要避光保存，防止發生淬滅現象，影響抗體的使用。

★  當進行多重檢測的時候，染料要避免重疊，選擇光譜距離較遠的染料進行孵育。

★  想要保存印跡膜，需要將其避光保存。

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