圖1. 基因編輯示意圖^[1]
 

研究歷史

20世紀80年代初，胚胎干細胞分離和體外培養的成功為基因敲除奠定了技術基礎。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組(homology recombination, HR)的存在為基因敲除奠定了理論基礎^[2]。為了編輯基因，傳統的靶向特定等位基因的同源重組技術被使用，但是，這個方法在當年來說，存在效率低、勞動成本高的缺點，嚴重制約了基礎研究和臨床應用，這就需要科學家探索更為簡潔高效的基因編輯技術。

為了實現利用簡單的方法使特定基因失去功能，科學家研發出了RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術，希望更易于研究哺乳動物細胞的基因功能，它具有操作簡單、效果明顯等優點。但RNAi不能作用于所有基因和某些細胞類型(如神經元)，而且存在位置效應、臨時性和不完全敲除的缺點^[3]。

隨著各種基因編輯技術的進步，如：鋅指核酸酶技術(zinc finger nuclease，ZFN)^[4]、轉錄激活樣效應物核酸酶技術(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)^[5]和成簇的規律間隔的短回文重復序列系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR -associated (Cas) 9 system，CRISPR/Cas9)^[6]等技術技術更迭，基因編輯領域也發生了革命性的改變。

今天小編就帶大家重新進入一下CRISPR/Cas9 技術和RNA干擾的世界吧，一起來回顧歷史哦~

圖2.http://www.sohu.com/a/284394775_704327^[7]

CRISPR/Cas9基因敲除

基因敲除(knockout)是指利用遺傳工程技術，針對某個特定已知基因序列，改變生物的遺傳基因，令其功能喪失作用，并進一步對生物體造成影響，進而推測出該基因的生物學功能。CRISPR/Cas9 是近年來發展最快的新基因敲除技術，它廣泛存在于許多原核生物基因組中，其中的域型CRISPR/Cas9 系統可以依賴Cas9內切酶家族靶向剪切外源 DNA。轉錄后，每個crRNA (CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)結合在一起，并和Cas9核酸酶形成一個復合物^[3]。Cas9核酸酶在crRNA 的指引下，識別保守的間隔相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)并靶向結合到 DNA 上，從而切割 DNA。這個技術操作簡單快捷、成本低廉、脫靶效應較低，已經成為基因功能研究領域強有力的武器，極大地加速了藥物靶點的篩選驗證及新藥的研發。

圖3. CRISPR/Cas9技術工作示意圖^[8]

RNA干擾

RNA干擾是指小分子雙鏈RNA可以特異性地降解或抑制同源mRNA表達，從而抑制或關閉特定基因表達的現象，其主要是通過短干擾RNA (short interfering RNA，siRNA)和短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)來調節基因表達^[9]。dsRNA在Dicer 酶的作用下可產生一系列長度為21~22 nt的siRNAs，后者在細胞內 RNA 解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，隨后由反義siRNA再與體內一些酶(包括內切酶、外切酶、解旋酶等)結合形成 RNA 誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。具有核酸酶功能的RISC與外源性基因表達的mRNA同源區進行特異性結合，在結合部位切割 mRNA。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發宿主細胞針對這些mRNA的降解反應，封閉內源性基因的表達，使該基因失活，最終達到基因沉默的作用^[3]。

圖4. RNA干擾的示意圖^[10]

CRISPR/Cas9基因敲除與RNA干擾優勢對比

就目前來說，CRISPR/Cas9 技術的效率已經非常高，基本可以在經過一次打靶過程就可以得到基因敲除的小鼠，而傳統的基于同源重組的技術則需要更長的時間。基于CRISPR/Cas9基因敲除技術其成本低、制作簡便、快捷高效的優點，讓它迅速風靡于世界各地的實驗室，成為科研、醫療等領域的有效工具，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因；作為一種新型的靶向基因編輯技術，CRISPR/Cas9 技術已成功在斑馬魚、小鼠和大鼠等多個物種中得到了廣泛應用，此外該項技術不存在動物物種的限制，其在植物基因修飾中也取得了突破，如大豆、煙草、水稻和小麥中都取得了成功。

CRISPR 技術的優勢是能永久性地改變基因組DNA的序列，但在基因沉默方面RNAi 技術也有其獨特的優勢。具體來說首先RNAi無需引入額外的蛋白質因子，更安全，成本更低；其次RNAi 是一種轉錄后水平的可逆的基因沉默技術，只需通過siRNA的添加與否，或使用小分子化合物調控siRNA表達載體上誘導型啟動子的活性就能實現對靶基因的沉默與開啟；最后RNAi在轉錄后水平調節基因的表達，故設計siRNA時只需參考轉錄組數據^[11]。

應用

1、CRISPR/Cas9基因敲除

CRISPR/Cas9技術在藥物研發的功能基因篩選過程中，只需要將一個sgRNAs文庫導入細胞中，再通過相關表型的評估，即可實現對基因組的大規模定點編輯和篩選，進而揭示基因的生理功能，為新藥研發提供可靠的靶標。

CRISPR/Cas9技術不僅僅限于基因敲除，包括大片段的敲進，點突變，人源化替換等策略都已經在動物模型構建中已大展身手，大大縮減了構建動物模型的時間和經費。而且已廣泛應用于各種的基因編輯模型構建（主要包括腫瘤和干細胞系）。此外該技術應用于人體的基因治療也在快速發展過程中，將為人類疾病的治療帶來巨大的幫助^[12]。

2、RNA干擾

① 基因功能研究

由于RNAi具有很好的特異性和有效的干擾活力，可以使特定基因沉默，使其功能喪失或降低表達，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具^[9]。已有研究表明siRNA能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，而且抑制基因表達的時間可以控制在發育的任何階段，產生類似的基因敲除的效應。

② 病毒性疾病的治療

研究表明，人們通過合成一段針對特定病毒基因的siRNA，并將之導入該病毒感染的細胞，能夠有效地抑制該病毒的復制，阻斷病毒對細胞的感染。并且，可貴的是，siRNA在病毒感染的早期就能發揮抑制作用。因而，siRNA可用來治療病毒性疾病。

③ 腫瘤病的治療

腫瘤是多個基因相互作用的基因網絡調控的結果，傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一區段序列的siRNA分子，只注射一種siRNA即可產生多個基因同時剔除的效果，也可以同時注射多種siRNA而將多個序列不相關的基因同時剔除。

總結

綜上所述，在基因編輯技術中，基因敲除技術與RNAi技術各有千秋，都被積極地應用于一些生物問題的研究，包括一些人類疾病，極大地滿足了研究人員操作不同類型基因組的目的，不僅可以作為基因編輯的工具，也可用于基因表達調控。這就好比“寶刀屠龍，號令天下；倚天不出，誰與爭鋒”。

今天的干貨就暫時到這里啦，各位寶寶們是不是墨水滿滿的呢，咳咳，如果感興趣，一定要隨時關注留意小編，定不會錯過你想要的，咱們下次再會~小編悄悄地來，又輕輕地走，不要帶走任何遺憾哦

參考資料

[1]https://www.cnblogs.com/pythonicanus/p/10111230.html

[2]Smithies O, Gregg R G, Boggs S S, et al. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal β-globin locus by homologous recombination[J]. Nature, 1985, 317(6034): 230-234.

[3]李 妤，趙紅業，崔 勇，魏紅江，李梅章. 基因編輯技術的研究進展[J].生命科學研究，2017，21(3)

[4]Hauschild-Quintern J, Petersen B, Cost G J, et al. Gene knockout and knockin by zinc-finger nucleases: current status and perspectives[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2013, 70(16): 2969-2983.

[5]Cermak T, Doyle E L, Christian M, et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting[J]. Nucleic Acids Research, 2011, 39(12): e82.

[6]Cong L, Ran F A, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823

[7]http://www.sohu.com/a/284394775_704327

[8]https://www.iiiff.com/article/24961

[9]Wilson R C, Doudna J A. Molecular mechanisms of RNA interference[J]. Annual Review of Biophysics, 2013, 42: 217-239

[10]http://blog.sina.com.cn/s/blog_445dac3b0102x8kb.html

[11]尚仁福，吳立剛. RNA干擾的機制及其應用[J]. 生命科學，2016，28(5)

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