李斯特氏菌的檢驗方法！
 
李斯特菌（也稱李氏桿菌）引起的急性傳染病，以敗血病為主要癥狀，伴有內臟器官和中樞神經系統病變。李斯特菌是1926年英國南非裔科學家穆里在病死的兔子體內首次發現的，為紀念近代消毒手術之父、英國生理學家約瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三屆國際微生物學大會命名為李斯特菌。
單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛生微生物檢驗中，必須加以重視。
李斯特菌在環境中無處不在，在絕大多數食品中都能找到李斯特菌。肉類、蛋類、禽類、海產品、乳制品、蔬菜等都已被證實是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒嚴重的可引起血液和腦組織感染，很多國家都已經采取措施來控制食品中的李斯特菌，并制定了相應的標準。
其中單增李斯特菌是唯一能引起人類疾病的。單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。
實驗步驟
1. 增菌培養
將未開封的測試片貯藏在≤8℃的環境下，并在包裝上標示的有效期內使用。在高濕度的地方，最好在使用前將測試片回復到室溫。
取回的樣品應在4℃下處理、存放和運送，如果是冷凍樣品，則在檢驗前要保持冷凍狀態。
取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無選擇性試劑增菌肉湯（EB）的均質杯中進行均質，然后轉入三角瓶中，30℃培養4h，加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線菌酮，繼續培養20h和44h.。
2. 分離
共培養24h和48h后，取EB培養物分別在OXA和LPM或加七葉苷/Fe3 LPM瓊脂平板上劃線。PALCAM瓊脂可替代LPM瓊脂。將OXA和PALCAM平板置于35℃培養24-48h，LPM平板在30℃培養24-48h。然后，把LPM平板放于解剖鏡載物臺上，以450角入射光從平板下面照射平板，通過目鏡垂直向下觀察尋找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光澤的蘭色或灰色。用已知陽性菌和陰性菌劃線的平板作對照。
已開封的測試片，將開口反折，用膠帶封好。
加入七葉苷和Fe3 的LPM平板不用斜射光系統，選擇可疑菌落的方法與在OXA上選擇可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周圍有一個黑色環，其它菌也可形成黑色環，但形成時間要在兩天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。
在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5個或更多的典型菌落，分別劃線于TSAYE平板上以得到更純、更典型的單個菌落。食品檢驗中在TSAYE平板上純化是必須的，因為在PALCAM和OXA或LPM平板上分離菌落時可能沾有不可見的受抑微生物。挑取5個典型菌落的原因是一個樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培養24-48h，如果不用于動力觀察，也可在35℃培養。
3. 鑒定步驟
為防止暴露于潮濕的環境中，請不要冷藏已開封的測試片。將膠帶封好的測試片貯藏在低溫干燥的地方，保持時間不超過1個月。請勿將測試片放在溫度> 25℃和(或)相對濕度>50%的環境中。
1）觀察TSAYE平板通過斜射光觀察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對照。
2）從30℃或更低溫度下培養的TSAYE平板上挑取典型菌落做成濕玻片在油鏡下觀察。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液制成。如果菌量太少，菌體黏附于載玻片上而呈現非運動性。李斯特氏菌是細短桿菌，可見輕微的旋轉及翻滾。與已知的李斯特氏菌的對照相比，球形、大的桿狀且快速泳動的都不是李斯特氏菌。
3）挑取典型菌落進行過氧化氫酶實驗，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應。
4）取16-24h的培養物進行革蘭氏染色，李斯特氏菌呈革蘭氏陽性桿菌。但是陳舊培養物革蘭氏染色會發生變化，而且菌體可成球形。在染色過重的玻片上菌體有呈柵狀排列的趨勢，易誤認為白喉菌而錯判。
4. 用涂抹棒、海棉或其它采樣設備收集環境樣本。濕潤采樣設備的液體應≤10 mL。濕潤劑可以是無菌水、緩沖蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)，或中和緩沖液，如Letheen肉湯或Dey/Engley (DE)中和肉湯。
5）挑取典型菌落接種于TSBYE肉湯管中，35℃培養24h用做糖類發酵和其它生化項目實驗。TSBYE肉湯管在4℃下可存放幾天，也可反復接種。
6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺種到5%的綿羊血或馬血瓊脂平板上，刺種時避免觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時設陽性對照（單核細胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對照（英諾克李斯特氏菌），35℃培養48h。單核細胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血環。
7）在明亮的光照下，觀察經穿刺的血瓊脂平板，單核細胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點產生較清晰的β-溶血環，英諾克李斯特氏菌不產生溶血現象，而綿羊李斯特氏菌產生界限明顯的較大溶血環，在此不要試圖進行種間的區分，但要記錄下溶血反應的特征，CAMP試驗可區分它們間的溶血反應。
8）硝酸鹽還原試驗（選做）。用TSBYE肉湯培養物接種于硝酸鹽肉湯中，35℃培養5天后，加入0.2mL試劑A，再加入0.2mL試劑B，混合，出現紫紅色為陽性反應，表明硝酸鹽已被還原，如無顏色出現，在試管內再加入少量鋅粉，放置1h，如出現紫紅色，表明硝酸鹽仍存在，未被細菌還原。只有默氏李斯特氏菌還原硝酸鹽，因此，從格氏李斯特氏菌中區分出默氏李斯特氏菌就必須進行這唯一的試驗。本試驗還有一等效試驗，即加入0.2mL試劑A后，再加入0.2mL試劑C，出現橙色表明硝酸鹽已被還原。如未出現顏色反應，也加入少量鋅粉，若出現橙色表明硝酸鹽未被還原。
5. 在無菌環境下在收集的樣品中添加5 mL，20-30℃，滅過菌的緩沖蛋白胨水(BPW)溶液。不要將Petrifilm EL測試片與Vermont 培養基(UVM)、Fraser肉湯、李斯特菌增菌培養基 (LEB)或緩沖李斯特菌增菌培養基(BLEB)共用。
9）將TSBYE培養物穿刺到SIM和MTM試管中，室溫培養7天，每日觀察，李斯特氏菌呈典型傘狀生長。在MTM中傘狀生長更典型。同時，30℃的TSBYE培養物在油鏡下可見細菌作翻轉運動。
10）將TSAYE肉湯培養物分別接種于0.5%（W/V）葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發酵管內（可選用倒立發酵管），35℃培養7天，呈陽性反應的李斯特氏菌產酸不產氣，李斯特氏菌發酵鼠李糖和木糖的情況見下表。所有李斯特氏菌對葡萄糖、七葉苷、麥芽糖均能發酵，除格氏李斯特氏菌均不能發酵甘露醇。如果在OXA、PALCAM或加七葉苷/Fe3 的LPM分離平板上菌落色素很明顯，則七葉苷試驗可免做。
6. 混合，蠕動或旋轉樣品與BPW的混合液將近一分鐘。將樣品置于室溫(20-30℃) 1h，最久不超過1.5 h，以修復損傷的李斯特菌。
將TSBYE肉湯培養物接種到3mLTSBYE肉湯中，35℃培養24h，接種2支TSAYE瓊脂斜面，35℃培養24h。用3mL0.01mol/l磷酸鹽緩沖液將斜面菌苔洗下，菌懸液于80℃水浴中加熱1h，以2500r/min離心30，棄去2mL上清夜，將剩余液與沉淀混勻制成菌懸液，進行血清學玻片凝集試驗。
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