作者
Eva Graf
安捷倫科技有限公司
Waldbronn, Germany

摘要
RNA 測序文庫制備工作流程的成功與否在很大程度上取決于 RNA 起始材料的質(zhì)量。采用 Agilent RNA ScreenTape 分析法獲得的 RNA 完整值當(dāng)量 (RINe) 是一種評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) RNA 測序的樣品完整性的可靠且可重現(xiàn)的指標(biāo)。由于 RNA 降解以及樣品體積有限，從福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 組織中提取 RNA 樣品進(jìn)行文庫制備具有挑戰(zhàn)性，因此建議針對(duì) FFPE RNA 文庫制備采用定制方案。FFPE RNA 樣品的片段大小分布對(duì)文庫產(chǎn)率具有重要影響，可以將其描述為大于 200 個(gè)核苷酸的 RNA 片段所占的百分比，用 DV₂₀₀ 質(zhì)量指標(biāo)來表示^[1]。Agilent RNA ScreenTape 和安捷倫高靈敏度 RNA ScreenTape 分析法有助于對(duì)從 FFPE 組織中提取的降解 RNA 樣品進(jìn)行高可重現(xiàn)的 DV₂₀₀ 評(píng)估。Agilent TapeStation 分析軟件能夠通過區(qū)域分析對(duì) DV₂₀₀ 數(shù)據(jù)進(jìn)行簡單評(píng)估和處理，自動(dòng)進(jìn)行重復(fù) DV₂₀₀ 分析。

技術(shù)詳情
使用配有 Agilent TapeStation 分析軟件（A.02.02版）的 Agilent 4200 TapeStation 系統(tǒng)。RNA ScreenTape（部件號(hào) 5067-5576）和試劑（部件號(hào) 5067-5577 和5067-5578），以及安捷倫高靈敏度 RNA ScreenTape（部件號(hào) 5067-5579）和試劑（部件號(hào) 5067-5580  和 5067-5581）均購自安捷倫科技公司。除非另有說明， 否則所有分析均按照生產(chǎn)商的方案和指南進(jìn)行。采用 ScreenTape 分析法對(duì)所有樣品進(jìn)行分析，每個(gè)膠條包含梯度分子量內(nèi)標(biāo)上樣。從 FFPE 組織中提取的 RNA 樣品由國家腫瘤疾病中心（簡稱 NCT，位于德國海德堡）組織庫友情提供，此過程符合組織庫的規(guī)定，并得到了海德堡大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

數(shù)據(jù)分析
DV₂₀₀ 表示大于 200 個(gè)核苷酸的 RNA 片段占所有 RNA  片段的百分比。通過定義大于 200  個(gè)核苷酸的區(qū)域，可以利用 TapeStation 分析軟件計(jì)算得出 DV₂₀₀。該軟件提供了區(qū)域設(shè)置的多種方式，適用于從低到高的各種樣品通量。如需了解更多信息以及關(guān)于區(qū)域分析的演示視頻，請咨詢安捷倫信息中心(AIC)。

單個(gè)樣品的區(qū)域設(shè)置
為單個(gè)樣品定義 DV 200 區(qū)域，請單擊 Region，然后右鍵單擊電泳圖以添加區(qū)域。可以通過向左或者向右滑動(dòng)來單獨(dú)調(diào)節(jié)區(qū)域邊界。

數(shù)據(jù)文件的區(qū)域設(shè)置
如果要將 DV 200 區(qū)域定義為默認(rèn)適用于單個(gè)數(shù)據(jù)文件中所有樣品，請單擊 Region，然后單擊 Region Settings，在對(duì)話框中輸入?yún)^(qū)域下限和上限（圖 1）。如需在電泳圖中識(shí)別該區(qū)域，請輸入DV₂₀₀ 作為區(qū)域注釋。要將該區(qū)域應(yīng)用于現(xiàn)用文件中的所有樣品，請選擇 This File。



自動(dòng)區(qū)域設(shè)置
要將 DV₂₀₀ 區(qū)域定義為默認(rèn)適用于所有重復(fù)的 FFPE RNA 樣品分析，請單擊 Region，然后單擊 Region Settings，在對(duì)話框中輸入?yún)^(qū)域下限和上限（圖 1）。如需在電泳圖中識(shí)別該區(qū)域，請輸入
DV₂₀₀ 作為區(qū)域注釋。要將該 DV₂₀₀ 區(qū)域應(yīng)用于與現(xiàn)用文件分析方法相同的所有文件，請選擇 Assay Files。

DV₂₀₀ 區(qū)域定義完成后，每個(gè)樣品的值將顯示在區(qū)域表中的 % of Total 列（圖 2）。可以通過選中區(qū)域表，導(dǎo)出所有區(qū)域數(shù)據(jù)并生成報(bào)告。請注意，TapeStation 分析軟件的區(qū)域表、導(dǎo)出文件和報(bào)告中顯示的濃度，是指所定義區(qū)域的濃度；總樣品濃度顯示在樣品表中。



結(jié)果與討論
重現(xiàn)性
對(duì)三個(gè) FFPE RNA 樣品進(jìn)行五次獨(dú)立重復(fù)測定，以對(duì)采用 RNA 和高靈敏度 RNA ScreenTape 分析法獲得的 DV₂₀₀ 重現(xiàn)性進(jìn)行驗(yàn)證。兩種方法均表現(xiàn)出較高的重現(xiàn)性，CV 小于 5%（圖 3）。



濃度依賴性
采用 RNA 和高靈敏度 RNA ScreenTape 分析法對(duì)三個(gè)單獨(dú) FFPE RNA 樣品的系列稀釋溶液進(jìn)行分析，以確定 DV₂₀₀ 分析的一致性（表 1）。RNA ScreenTape 分析法和高靈敏度 RNA ScreenTape 分析法獲得的 DV₂₀₀ 均表現(xiàn)出較高的精確度，其CV 值小于 5%。



如圖 4 所示，系列稀釋溶液分析表明， 當(dāng)測量濃度高于特定分析濃度范圍下限時(shí)，DV₂₀₀ 評(píng)估是最精確的。



嚴(yán)重降解的 FFPE 樣品可能會(huì)下移到靠近下位分子量內(nèi)標(biāo)處，而不能完全與下位內(nèi)標(biāo)分離，特別是在樣品濃度接近特定定量范圍上限時(shí)。在這種情況下，稀釋樣品產(chǎn)生的 DV₂₀₀ 結(jié)果更為準(zhǔn)確（見圖 5）。

分析方法比較
采用 RNA ScreenTape 分析法對(duì)來自不同人體組織的 20 個(gè) FFPE RNA 樣品進(jìn)行分析，然后將樣品按 1:20 的比例稀釋，再用高靈敏度 RNA  ScreenTape  分析法進(jìn)行分析。RNA 分析法獲得的 DV₂₀₀ 范圍為 40%–74%，而用高靈敏度 RNA 分析法分析相應(yīng)樣品的結(jié)果為這些值的 101±5%。為了驗(yàn)證 RNA 和高靈敏度 RNA ScreenTape 分析法測得的 DV₂₀₀ 的可比性，將兩種方法得到的值繪制在一起，如圖 6 所示。

結(jié)論
Agilent RNA 和安捷倫高靈敏度 RNA ScreenTape 分析法，結(jié)合 Agilent 4200 TapeStation 系統(tǒng)，可以輕松快速地對(duì)FFPE RNA 樣品進(jìn)行質(zhì)量分析。Agilent TapeStation 分析軟件在進(jìn)行區(qū)域設(shè)置后 DV₂₀₀ 以總百分比顯示。RINe 算法不會(huì)影響 DV₂₀₀ 的計(jì)算。由 RNA 和高靈敏度 RNA ScreenTape  分析法計(jì)算得到 DV₂₀₀ 具有較高的重現(xiàn)性，兩種方法得到的結(jié)果 高度一致。為了獲得最佳性能，建議與樣品一起進(jìn)行梯度分子量內(nèi)標(biāo)分析。在特定分析范圍內(nèi)，系列稀釋溶液的 DV₂₀₀ 具有一致性。對(duì)于未能與內(nèi)標(biāo)有效分離的高度降解樣品，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行稀釋以獲得最準(zhǔn)確的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)
<sup>1.     Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Technical Note, publication number 470-2014-001. https://www.illumina.com/ documents/products/technotes/ technote- truseq-rna-access.pdf

僅限研究使用。不可用于診斷目的。
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2017 年 9 月 28 日，中國出版
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