NACIA數字PCR用引物與普通PCR引物設計要求不同：普通PCR的目的是獲得目的基因，對非特異性反應和引物二聚體要求不嚴格；而數字PCR引物跟real-time PCR引物一樣對非特異性反應和引物二聚體要求嚴格。
NACIA數字PCR引物及探針設計的總體原則
v 先選擇好探針，然后設計引物使其盡可能的靠近探針。
v 所選列應該高度特異，盡量選擇具有最小二級結構的擴增片段。
v 擴增長度應不超過400bp，理想的最好能在50-150bp內。
v 保持GC含量在30%~80%之間。
v 為了保證效率和重復性，應避免重復的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續的G）。
v 將引物和探針互相進行配對檢測，以避免二聚體和發夾結構的形成。
v 一些需額外考慮的因素：
☆ 引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現3個或3個以上連續相同的堿基 。
☆ 如果不能避免二級結構，那么就要相應提高退火溫度。
☆ 盡量避免Dimer（二聚體）配對區域在3’末端。
☆ 盡量避免3’末端連續幾個堿基錯配形成False priming（錯配）
☆ 衡量二級結構的穩定性
如果自由能值大于0 則該結構不穩定從而不會干擾反應，如果自由能值小于0 則該結構可以干擾反應
盡量保證自由能的絕對值<10（可選）
為了避免基因表達過程中檢測到DNA，設計應盡量跨內含子區，這可確保擴增的產品只能使用mRNA作為模板。 NACIA數字PCR引物設計基本原則
☆ 擴增片段長度：50-150個堿基
☆ 引物長度：18-24個堿基（20個堿基最優）
☆ Tm值：58℃到 60℃，引物之間的TM相差避免超過2℃
☆ GC含量：30%到80%
☆ 3’端的最后5個堿基內不應有超過2個G+C
☆ 盡量避免重復的核苷酸序列，尤其是不能有4個連續的G
☆ 探針位置盡可能地靠近上游引物，但不能重疊
NACIA數字PCR探針設計基本原則
☆ 探針長度：13-25個堿基（MGB探針）；13-30個堿基（普通Taqman探針）
☆ Tm值：68 °C 到 70 °C(PrimerExpress 計算結果)；通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃）
☆ GC含量：30%到80%
☆ 5’端第一個堿基不能為G
☆ 盡量避免重復的核苷酸序列，尤其是不能有4個連續的G ；避免6個連續的A出現
☆ 對于MGB探針，盡量避免在探針的中部出現2個或2個以上連續的C,3'端的堿基應避免為“GGG”或“GGAG”
☆ 對于FAM 標記的探針，5’端的第二個堿基不能為G
☆ 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量
NACIA數字PCR探針熒光標記物選擇: NACIA數字PCR多重探針設計原則
☆ 所有靶基因的引物或探針的Tm 值要相接近，引物的Tm 值建議在55-60℃，探針的Tm 值高于引物Tm 值5-10℃。
☆ 不同靶基因的探針標記不同的熒光基團，比如FAM、HEX或CY5，并且要選擇發射波長之間滲透最小的熒光報告基團，
☆ 同時要與數字PCR 系統的熒光檢測通道參數兼容。 NACIA數字PCR推薦引物探針設計軟件:Beacon designer, Primer 3 ,Primer express等。