m6A RNA甲基化是當前在LncRNA，環狀RNA等非編碼RNA之后最為火熱的科研明星，到底有多火？擺出數據告訴你！

2019年才過去一半還不到，已發表文章數就已占去年的7成。RNA甲基化領域，不僅文章數量多，高分文章也有許多。據統計，僅2019年上半年就發表了多篇Nature，Cell，Cell Stem Cell，Nature Immunolgy這類的頂級期刊，10分以上m6A文章就有18篇之多。

m6A RNA甲基化作為2018年國自然熱點，申請的課題主要圍繞writer，eraser和reader。
做膩了writer，eraser？那讓我們來看看reader，YTHDF家族由于在核外參與蛋白翻譯和降解，是reader里最明星的研究對象，可m6A reader酶千千萬萬，您研究的基因除了YTHDF家族外，可能還與其他reader結合。

今天，讓我們開開腦洞，談一談另一個reader hnRNPA2B1，看看像這類核內核外都有表達的reader是怎么來做研究的。

結直腸癌Colorectal cancer（CRC）是一類腸道發生癌變的疾病。目前，關于CRC發生和轉移相關的分子機制還未有詳細報道。已有研究指出，LncRNA分子在腫瘤發生，發展，甚至是遷移的過程中發揮重要機制。因此，本文以LncRNA為切入點，首先通過LncRNA測序找到一個目標LncRNA---RP11，在CRC中高表達的趨勢，且表型與細胞遷移正相關。接著，通過RNA Pull Down-質譜技術，證實該LncRNA與下游蛋白hnRNPA2B1是直接結合關系，該蛋白可是m6A RNA修飾的明星閱讀酶（Reader）呀！那這個LncRNA勢必也參與了m6A RNA 甲基化的過程。接下來，讓我們跟隨作者思路，看看LncRNA結合m6A的機制類文章是怎么做的。

 

發表期刊：Molecular Cancer
影響因子：7.8
實驗方法：LncRNA 測序，MeRIP-qPCR，RNA Pull Down，RIP，LncRNA定量PCR，mRNA定量PCR
實驗材料：CRC臨床樣本等，結直腸癌細胞系等

1. LncRNA RP11在CRC細胞和組織中高表達
CRC組織（癌癥1期和癌癥3期）與癌旁組織分別進行LncRNA測序（云序可提供此服務），篩選到在癌癥1期和3期都差異高表達的LncRNA---RP11。在測序樣本和32個臨床樣本組織中，通過LncRNA 定量PCR證實其在實驗組中高表達。已有結腸癌和直腸癌數據庫結果也證實這類表達趨勢。RP11在多個結直腸癌細胞系中廣泛表達，并在CRC患者轉移性淋巴結組織原代培養的SW620細胞中高表達。

    

圖1. RP11在CRC組織和細胞中高表達

2.RP11在體內和體外誘導CRC細胞散布
為進一步闡明RP11在體內和體外的功能機制。作者首先證實RP11過表達細胞系能夠顯著促進細胞的遷移能力。由于此過程影響了E-Cad，FN和Vim等標志物蛋白的表達量，因此可能與EMT和癌癥轉移相關。接著，作者在異種移植腫瘤的裸鼠體內高表達RP11基因，發現該基因能夠促進腫瘤的增殖。作者在裸鼠體內通過尾部注射方式，導入穩定高表達RP11的癌癥細胞，飼養8周后，發現這些細胞轉移至小鼠肝臟組織中。

   

圖2. 體外：RP11促進癌細胞遷移
體內：RP11促進癌組織增殖和遷移

3.轉錄因子Zeb1介導RP11調控CRC細胞散布
已有研究表明，LncRNA能夠通過順勢調控機制影響其周圍的轉錄本表達。因此，本研究在LncRNA RP11周圍找到了6個轉錄本，分別為NUDT12, C5orf30, PPIP5K2, GIN1, RP11-6 N13.1和CTD-2374C24。通過mRNA定量PCR證實以上轉錄本不管是在RP11高表達組以及RP11表達量最高的SW620細胞系中，都未差異表達。所以，RP11的功能機制不是通過順勢調控的模式影響的。

既然不是順勢調控引起的，那還會是什么呢？

是否是下游結合蛋白呢？
為了證實以上猜想，作者在過表達細胞中通過mRNA定量PCR技術，檢測了多個與EMT相關因子的表達量，檢測結果顯示Zeb1與RP11的表達模式正相關。并且在Zeb1過表達細胞系中，證實能夠影響FN和Vim標志物的表達量。因此，RP11的下游可能是Zeb1。
為了驗證前面的猜想，作者通過Zeb1 RIP-LncRNA PCR（云序可提供此服務）和RP11 Pull Down-質譜技術（云序可提供此服務），證實Zeb1與RP11在mRNA和蛋白層面都不是直接結合的關系。

        

圖3. Zeb1可能是RP11間接的下游

4.RP11-hnRNPA2B1-mRNA復合體參與RP11調控Siah1和Fbxo45
同樣的，作者推測下游蛋白可能是Siah1和Fbxo45。在mRNA層面，通過RP11 RIP-mRNA PCR，證實兩者調控了RP11和Zeb1的表達。在蛋白層面，通過RP11 Pull Down-質譜技術證實三者并非直接結合。

為證實RP11是如何調控下游mRNA Siah1和Fbxo45，作者在前期RP11 Pull down-質譜結果中，找到與RP11直接結合的hnRNPA2B1蛋白。hnRNPA2B1 RIP-mRNA PCR實驗證實RP11，Siah1和Fbxo45在mRNA層面是直接結合的關系。已有研究表明hnRNP2B1是一種RNA結合蛋白，在細胞核及細胞質中廣泛分布。通過結構分析LncRNA結構，證實其能夠與Siah1的CDS區和Fbxo45的3’UTR區結合。總的來說，RP11通過形成RP11-hnRNPA2B1-mRNA復合體調控下游mRNA Siah1和Fbxo45的表達。

         

圖4. RP11形成RP11-hnRNPA2B1-Siah1-Fbxo45復合體參與細胞遷移

5. m6A修飾參與CRC細胞中RP11表達上調機制
首先，作者懷疑RP11的高表達與DNA甲基化相關，通過DNA甲基化抑制酶處理細胞后，發現RP11表達量不變，證實在CRC細胞中RP11表達量與DNA甲基化無關。同時，實驗也證實其與組蛋白乙酰化無關。

已有研究表明m6A修飾調控LncRNA的表達及功能過程。作者通過MeRIP-qPCR技術（云序可提供此服務），在三種細胞系中都證實了RP11上發生了m6A RNA甲基化修飾。并且分別過表達甲基化轉移酶METTL3和去甲基化轉移酶ALKBH5都能夠影響RP11的表達。接下來，作者旨在CRC細胞中深入研究m6A 修飾是如何調控RP11表達的？首先，筆者借助Act-D物質抑制轉錄過程，發現在Mettl3過表達組中RP11的表達量沒有受到影響，原因可能是Mettl3促進RP11在染色質中積累，從而對RP11的表達起到了穩定作用。m6A reader蛋白hnRNPA2B1參與了此過程。

圖5. RP11存在m6A修飾并受Mettl3和AlKBH5調控

6. m6A/RP11/Zeb1間的關系和CRC細胞體內的進展
通對分析大量不同分期臨床樣本表達情況表明m6A修飾先調控RP11，RP11在影響Siah1-Fbxo45/Zeb1。借助KM曲線，作者發現高表達RP11直腸癌患者的生存情況并不樂觀。同時，也分析了下游基因與病人其他臨床指標間的關系。總體而言，證實了m6A/RP11/Zeb1促進了CRC的發生發展過程。

總結
在本研究中，作者首先通過LncRNA高通量測序手段，在CRC疾病組中篩到高表達的LncRNA----RP11，并證實其能夠促進腫瘤遷移。
隨后，作者旨在研究RP11下游結合蛋白是什么，是如何調控促進遷移表型的。
一方面：借助LncRNA Pull Down，快速鎖定與RP11結合的蛋白就是m6A reader hnRNPA2B。通過RIP-PCR，快速找到與該蛋白結合的RNA是RP11。另一方面，借助MeRIP-qPCR，證實在3種疾病相關細胞系中RP11上都存在著m6A 修飾的情況。同時，Mettl3作為其上游促進RP11穩定性，從而促進CRC的發生發展。

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全文鏈接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-019-1014-2

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