方法開發的四個簡化步驟
• ACE MDKs包括了為互補選擇性而精心設計的3支色譜柱。
• 色譜柱篩選是一種簡單而又功能強大的方法, 可以快速識別最合適的色譜柱。
• 通過篩選2種不同的流動相有機改性劑可以使方法更全面。
• 以下的流程圖總結了如何通過4個簡單步驟執行方法開發篩選。

開始

第一步：選擇流動相pH和緩沖液
根據分析物性質 (即pKa, logP和logD數據) 進行選擇。對于未知分析物，使用酸性流動相作為起點。

第二步：使用ACE 方法包 (3或6支色譜柱)
梯度掃描以MeOH和MeCN作為有機溶劑,進行5-95％梯度篩選。

第三步：查看數據

選擇最佳色譜柱和有機改性劑。

第四步：方法優化

如有必要, 檢查溫度, pH值, 梯度斜率,梯度范圍等。

是否實現分離？

是-方法開發完成

否-改變流動相條件（pH值,緩沖液等），回到第二步繼續實驗。

選擇色譜柱和粒徑尺寸。
由LC系統和用戶的偏好決定。對于400 bar的HPLC系統來說, 5μm 150 x 4.6mm是個不錯的選擇。
對于600 bar優化的HPLC系統, 可使用2 和3μm粒徑的較短色譜柱 (如100mm)。1.7μm粒徑的短柱 (如50mm)適用于UHPLC系統。

如何確定合適的篩選梯度時間？
梯度時間可以使用公式1計算。
VM可用公式2計算。

tG = 梯度時間 (mins.) k* = 梯度保留系數 (通常設置約為5) ΔΦ = 梯度范圍 (即對于5-95％B梯度，ΔΦ= 0.9) VM = 柱內體積 (mL) S = 5 對于小分子 (＜1000沓) F = 流速 (mL/min) L = 色譜柱長度 (mm) dc = 柱內徑 (mm）

請務必記住在下一次注射前, 在梯度洗脫后以至少10倍V_M (柱內體積) 進行一次等度重新平衡。

為何使用色譜柱篩選？

• 改變色譜柱的固定相可能對選擇性造成顯著影響 (圖1)。
• 在相同的流動相條件下, 篩選不同的色譜柱可以幫助您以更高的分辨率更快地實現所需的分離。

圖1：改變色譜柱固定相的影響。
色譜柱：50x2.1mm

流動相：A = 0.1％甲酸的水溶液，B = 含0.1%甲酸的甲醇:水(9:1 v/v)

梯度：5分鐘內3-100%B，
流速：0.06mL/min

溫度：40°C

檢測：UV，254nm

樣品：1）甲硝唑，2）芐醇，3）氫氯噻嗪，4）香草醛，5）羥苯甲酯，6）1,2-二硝基苯

• ACE MDKs將具有不同相互作用機制的色譜柱組合在一起, 以最大限度地提高選擇性并增加分離具有挑戰性的混合物的可能性。
• 性價比高, ACE MDKs與單支色譜柱價格相同！
• 兩種最受歡迎的ACE反相 (RP) MDK (參見下表) 包括了為利用不同的保留機制和最大化選擇性而獨特設計的相。
• 所有六個相都可以在反相 (RP) 條件下使用, 并且具有與C18一樣的穩定性。

¹近似值– 通過半定量機制加權和/或通過參考使用>100特征分析物的其他ACE相來確定。

• 其他的ACE方法包還有HILIC分析包, 生物大分子300Å分析包和實心核(UltraCore) 分析包
• 同樣提供微孔柱尺寸 (內徑0.5和1.0mm)。

成功范例
對乙酰氨基酚及有關物質