一步法反轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）廣泛用于RNA分析，如基因組表達(dá)、病毒檢測，從生命科學(xué)研究到診斷的許多領(lǐng)域，都有所應(yīng)用。一步法Crystal RT-數(shù)字PCR實現(xiàn)了直接對RNA樣本進行多重靶標(biāo)基因的檢測（內(nèi)參基因、多重目標(biāo)基因）和病毒RNA的絕對定量，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時實現(xiàn)了基因表達(dá)的細(xì)微差異的精確檢測。
一步法Crystal RT-數(shù)字PCR技術(shù)（Crystal RT-dPCR）實現(xiàn)了同一個反應(yīng)中，通過三個熒光通道進行三種不同的mRNA分析，可以顯著且準(zhǔn)確地區(qū)分1.5倍的基因表達(dá)差異（圖1）。
圖1：一步法Crystal RT-數(shù)字PCR（Crystal RT-dPCR）對人總RNA中mRNAs進行絕對定量
 對人總RNA進行1.5倍倍比稀釋，濃度變化范圍0.06ng/µl-3.6ng/µl，通過一步法Crystal RT-數(shù)字PCR對GUSB、ALB和TSN的三種mRNA進行三重絕對定量檢測。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix® 和FAM-、HEX和Cy5-標(biāo)記的三種TaqMan^TM 探針。重復(fù)三次的實驗結(jié)果顯示每個靶標(biāo)基因均具有良好的線性，準(zhǔn)確性和再現(xiàn)性。GUSB = 588. 8 cp / ng：ALB = 96.5 cp / ng：TSN = 980.6 cp / ng 
低表達(dá)水平轉(zhuǎn)錄子的定量檢測
對于背景高的總RNA中低豐度轉(zhuǎn)錄子的檢測極具挑戰(zhàn)，使用Crystal數(shù)字PCR技術(shù)在檢測低比例的轉(zhuǎn)錄子定量檢測具有出色的線性和重復(fù)性（圖2A）。即使在高濃度總RNA背景的情況下熒光強度一致，反應(yīng)效率不受影響（2μg-圖2B）。 對人總RNA進行2倍倍比稀釋，濃度變化范圍從2 µg 到125 ng，通過一步法Crystal RT-數(shù)字PCR對ALB的mRNA進行絕對定量。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix®和HEX-標(biāo)記的TaqMan^TM 探針。
線性圖顯示重復(fù)三次實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性（A），并且在微滴熒光散點圖中未觀察到熒光的變化（B）。 RFU：相對熒光單位。 *每次反應(yīng)27μL。
病毒RNA的絕對定量
登革熱1型病毒DEN-1和其他三種相近的血清型可以產(chǎn)生致命風(fēng)險，如登革熱出血熱、登革熱休克綜合征。一步法Crystal RT-數(shù)字PCR，可以實現(xiàn)2.5個小時內(nèi)，在無需標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下，對登革熱病毒載量進行絕對定量檢測，快速，友好且適用于所有實驗室和工作流程。 

圖3：一步法Crystal RT-數(shù)字PCR絕對定量DEN-1病毒載量 

將DEN-1病毒RNA（制造商通過數(shù)字PCR定量的標(biāo)準(zhǔn)品）中摻入300cp人總RNA作為背景，以ABL mRNA作為內(nèi)參。使用1x qscript XLT One-step RT PCR Toughmix®，F(xiàn)AM探針檢測DEN-1病毒，HEX探針檢測ABL基因。線性擬合程度達(dá)0.99，重復(fù)性好。

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