文章導讀
眾所周知，運動可以降低心血管疾病的發生概率。目前已有的研究報道主要集中在肌肉因子方面，因為它具有旁分泌和內分泌作用，能夠協調運動的多系統效應。然而，運動對心臟保護作用的潛在機制目前尚未可知。第四軍醫大學高峰、王立鋒科研團隊的最新研究成果表明，長期運動衍生的循環外泌體能夠傳遞心臟保護信號，并鑒定出外泌體miR-342-5p是一種新的心臟保護性運動因子，能夠對抗大鼠心肌缺血和再灌注（MI/R）引起的損傷。

發表期刊：Circulation Research
影響因子：15.211
實驗方法：miRNA測序
實驗材料：長期運動的人和大鼠的血漿（實驗組），不運動的人和大鼠的血漿（對照組）

本篇文章作者首先收集了運動和久坐的大鼠的血漿，從中分離出外泌體，運動大鼠血漿中外泌體為實驗組(exe-exo)，久坐大鼠血漿中外泌體為對照組(sed-exo)（圖1A），對外泌體進行鏡檢后（圖1B），又檢測了兩組的外泌體蛋白，結果顯示兩組間外泌體的量并沒有顯著差異（圖1C），且NTA分析也顯示，兩組的粒徑分布和血漿濃度沒有顯著性差異（圖1D和E）。然后作者用pkh26標記的外泌體和心肌細胞共培養，觀察到外泌體在孵育6小時后被心肌細胞內化(圖1F)。

圖1. 運動和久坐大鼠的外泌體數量無差異；外泌體能被心肌細胞內化

于是作者對人做了相同的檢測。運動員血漿外泌體為實驗組(Row-exo)和普通人的血漿外泌體為對照組(Con-exo)，結果與大鼠一致(圖2K和L)。此外，作者還發現將運動員的外泌體和人的心肌細胞共培養后，可以降低細胞凋亡(圖2M)，同時釋放血清乳酸脫氫酶LDH(圖2O)，并能增加心肌細胞活力(圖2N)。

圖2. 運動員和普通人的外泌體數量也無差異；外泌體也能被心肌細胞內化

2.運動分泌外泌體（exe-exo）對MI/R損傷有心肌保護作用
首先作者對兩組大鼠進行心肌缺血30 分鐘，再灌注24小時的損傷破壞，發現與久坐對照組(sed)相比，運動組(exe)大鼠心肌梗死面積減少，LDH降低，表明運動對MI/R損傷有明顯的心肌保護作用。

為研究運動分泌的外泌體對心肌保護的作用，作者從兩組大鼠的等體積血漿中分離出外泌體，并在MI/R損傷前的48小時，將攜帶pkh26標記的外泌體注射進正常大鼠心肌。接著對大鼠進行MI/R損傷，24小時后發現，與注射sed-exo的大鼠相比，注射exe-exo的大鼠心臟梗死面積顯著減小(圖3A)，同時伴有LDH降低。此外，作者還發現注射exe-exo的大鼠心臟功能得到改善，如MI/R后保留射血分數和分數縮短4周（圖3F-H）。綜上，exe-exo對MI/R損傷具有心肌保護作用。

圖3. Exe-exo能減少MI/R損傷導致的心肌梗死面積，改善心臟功能

3.miR-342-5p是exe-exo中誘導心臟保護的關鍵成分
為了探討miRNA在外泌體誘導的心臟保護中發揮作用的可能性，作者分別對兩組大鼠外泌體中的miRNA進行了高通量測序（云序可以提供此服務）。共檢測到14個差異表達的miRNAs(圖4A)，經q-PCR分析進一步驗證后，確定12個差異表達的miRNAs，其中11個表達上調(圖4B)。接著作者用缺氧/復氧（H/R）模型研究這11種上調的miRNAs如何影響心肌細胞的功能。發現miR-342-5p能顯著降低H/R作用下心肌細胞的凋亡，降低LDH的釋放，提高細胞活力(圖4C-E)。

為了更好地了解外泌體miR-342-5p的功能，作者又檢測了血漿外泌體處理的心肌細胞和心臟中miR-342-5p及其前體的水平。心肌細胞經exe-exo孵育和心臟注射48小時后，其中的miR-342-5p水平顯著升高(圖4G)，而前體m iR-342-5p水平無明顯變化，表明exe-exo將miR-342-5p傳遞給心肌細胞或心臟。此外，抑制miR-342-5p可以明顯減弱運動型血漿外泌體對心臟的保護作用(圖4H-J)。這些結果表明miR-342-5p在外泌體誘導的心臟保護中起著關鍵的作用。

于是作者檢測了運動員訓練前后血漿外泌體中的miR-342-5p含量，發現訓練后它的表達量比未受訓的時候提高了1.8倍(圖4F)。

圖4. miR-342-5p在exe-exo提供的心臟保護中起關鍵作用

4.miR-342-5p通過靶向結合心肌細胞中的Caspase 9和Jnk2發揮抗凋亡作用
為進一步研究miR-342-5p的作用機制，作者預測了miR-342-5p的靶基因，發現Caspase3、Caspase9和Jnk2能參與MI/R損傷和凋亡途徑(圖5A)。接著作者又發現增加miR-342-5p后，可以顯著降低Caspase9和Jnk2的蛋白水平，反之亦然，但沒有觀察到Caspase3基因表達的顯著改變(圖5B)。接著作者用熒光素酶進一步研究了Caspase9和Jnk2兩個基因與miR-342-5p的結合位點(圖5C)。此外，exe-exo孵育可以顯著抑制H/R誘導的心肌細胞裂解-Caspase3、裂解-Caspase9和磷酸(P)-Jnk2的表達(圖5D)。綜上，這些數據表明miR-342-5p通過靶向結合Caspase9和Jnk2，在心肌細胞中發揮抗凋亡作用。

圖5. miR-342-5p通過結合心肌細胞中的Caspase 9和Jnk2發揮抗凋亡作用

5.miR-342-5p通過靶向結合Ppm1f增強心肌細胞中AKT的磷酸化
生存信號AKT和ERK 1/2已被證實為心臟保護的關鍵分子。miR-342-5p可以上調心肌細胞中AKT的磷酸化，而ERK 1/2的磷酸化水平沒有明顯變化(圖6A)；在H/R心肌細胞中觀察到類似的現象(圖6B-D)。這些結果表明，miR-342-5p能激活心肌細胞的生存信號AKT。有趣的是，作者發現Ppm1f是miR-342-5p的潛在靶點，這是生信分析預測的唯一磷酸酶（圖6E）。如圖6F所示，miR-342-5p可以減少Ppm1f蛋白水平，反之亦然。熒光素酶報告分析進一步證實miR-342-5p可以直接結合Ppm1f的3'UTR區(圖6G)。值得注意的是，下調Ppm1f蛋白表達不僅顯著提高AKT的磷酸化水平(圖6H-I)，還可以降低H/R誘導的心肌細胞凋亡(圖6J)，這暗示AKT磷酸化水平升高可能在心肌保護中發揮作用。

圖6. miR-342-5p靶向結合Ppm1f，增強心肌細胞中AKT的磷酸化

6.內皮細胞是運動分泌外泌體中miR-342-5p的主要來源
為探討長期運動引起的大鼠循環外體miR-342-5p增加的原因，作者檢測了大鼠心臟、骨骼肌、主動脈、肝臟、脂肪組織、腎臟、脾臟和血漿中成熟miR-342-5p及其前體的表達，發現成熟miR-342-5p在多個組織中均有表達(圖7A)。而運動后，這些組織中的成熟miR-342-5p和前體miR-342-5p的量均顯著增加，出乎意料的是，它們的增加主要發生在主動脈而不是骨骼肌或心肌細胞中(圖7B-C)。進一步研究表明，去除主動脈內皮細胞后，成熟miR-342-5p和前體miR-342-5p的量可明顯降低，暗示內皮細胞是主動脈miR-342-5p的主要來源(圖7D)。接著，作者從運動大鼠和久坐大鼠中分離出主動脈內皮細胞，發現長期運動顯著增加了內皮細胞中成熟的miR-342-5p和前體miR-342-5p(圖7E)。此外，電鏡發現內皮細胞質中存在典型的多囊體(MVBS)，MVBS與質膜融合，釋放外泌體進入循環(圖7F)。這些結果提示血管內皮細胞是運動引起的外泌體中miR-342-5p的重要來源。

接下來，作者研究了內皮細胞釋放的外泌體是否能被心肌細胞所吸收。作者用cy3標記內皮細胞分泌的外泌體，并將其添加到人的心肌細胞中(圖7G)。共聚焦成像證實了cy3標記的miRNAs可以從內皮細胞向心肌細胞轉運(圖7H)。將cy3標記的外泌體與心肌細胞共同孵育，結果表明，受體心肌細胞中miR-342-5p增加(圖7I)。更重要的是，受體心肌細胞在H/R損傷后凋亡減少(圖7J)。綜上，這些結果表明內皮細胞釋放的mi-342-5p不僅可以被心肌細胞所吸收，而且可以保護心肌細胞免受H/R損傷。

7.層切應力(LSS)刺激可以上調內皮細胞miR-342-5p的表達
血流誘導的LSS是一種與運動有關的生理刺激物，被認為是運動誘導內皮細胞適應的中樞信號機制。為了研究LSS對miR-342-5p產生的影響，作者將人臍靜脈內皮細胞，分別置于靜止條件和LSS條件中培養。發現LSS不僅增加了細胞中成熟的miR-342-5p和pre-miR-342-5p(圖7K)，而且增加了外泌體miR-342-5p的分泌(圖7L)。這表明運動誘導的LSS可以直接刺激內皮細胞產生和釋放miR-342-5p。

圖7. 內皮細胞是運動分泌外泌體中miR-342-5p的主要來源；
miR-342-5p可以被心肌細胞吸收，并保護心肌細胞免受H/R損傷；
LSS可以直接刺激內皮細胞產生和釋放miR-342-5p

8.miR-342-5p在體內長期運動誘導的心臟保護中起著不可或缺的作用
為了探討體內miR-342-5p在運動誘導的心臟保護中的作用，作者使用帶有特定序列的病毒(AAV9)來抑制大鼠心臟中的miR-342-5p。游泳訓練前一周，在大鼠心肌內注射AAV-anti-miR-342-5p或AAV陰性對照(圖8A)，在訓練24小時后檢測到轉染AAV9。如圖8所示，運動訓練可以增加心臟中的miR-342-5p(圖8B)，同時減少Caspase 9、Jnk 2和Ppm1f表達，增強AKT的磷酸化；而降低miR-342-5p可減輕這些變化(圖8C)。重要的是，運動后，MI/R損傷導致的大鼠心肌梗死面積(圖8D-E)和心肌細胞凋亡(圖8F-G)明顯減少，降低miR-342-5p后，這種情況顯著減弱(圖8D-G)。在MI/R損傷前48小時注射miR-342-5p，可以顯著升高大鼠心臟的miR-342-5p表達水平(圖8H)，縮小心肌梗死范圍(圖8I)。綜上，這些體內數據表明，在長期運動誘導的心臟保護中，miR-342-5p對抵抗MI/R損傷起著至關重要的作用。

圖8. 在運動誘導的心臟保護中，miR-342-5p對抵抗MI/R損傷起重要作用

總結：
長期運動衍生的循環外泌體，雖然其血漿水平沒有顯著變化，但對MI/R損傷提供了深遠和持續的心臟保護。作者發現外體miR-342-5p是抑制凋亡信號(Caspase9和Jnk2)，增強心臟存活信號(P-Akt)的關鍵心臟保護分子。血管內皮細胞可能是外泌體miR-342-5p的主要來源，表明在運動提供的心臟保護中，血管與心臟之間的相互干擾。這些發現揭示了運動給予心肌保護可以作為一種新型的心肌保護作用機制，突出了miR-342-5p在缺血性心臟病預防和康復中的治療潛力。

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全文鏈接：
https://www.ahajournals.org/doi/abs/10.1161/CIRCRESAHA.118.314635

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