【經典文獻回顧】exFoxp3 Th17細胞的哲學獨白

“我是誰?我從哪里來?我要到哪里去？” 是柏拉圖提出的經典哲學三大問，小編每天早上起床前都要用這個問題叫醒我沉睡的靈魂。在本期帶來的經典文獻回顧中，請跟隨本文作者一起聽一聽ex Foxp3 TH17細胞的深刻哲學獨白吧！

自身免疫性疾病通常由調節性T細胞（Treg細胞）和產生干擾素17的輔助T細胞（ TH17細胞）失衡所導致，嚴重影響著人類的健康。但TH17細胞的來源仍然有很多未知，于是，主人公ex Foxp3 TH17細胞的獨白在自身免疫性關節炎中開始了。

第一問 我從哪里來

exFoxp3 TH17細胞悶悶不樂托腮思考：我作為TH17細胞的一員，感覺跟其他TH17細胞小伙伴兒們不是特別合群，常常有不一樣的感覺，我是從哪里來的呢？

讓我從頭開始捋一捋，先找找影響自身免疫性關節炎的關鍵人物：表達Foxp3的Treg細胞已經知道是抑制免疫應答的關鍵角色，小鼠缺失Foxp3會產生自身免疫疾病，持續表達則會抑制自身免疫，可見Foxp3表達的穩定性是兩者平衡的重要因素。

那么Foxp3的穩定性對自身免疫關節炎有什么影響呢？ Treg細胞的發展和功能受IL-2調控，Foxp3+T細胞由Foxp3+-穩定CD25（IL-2Rα）hi和Foxp3+-不穩定CD25lo細胞群組成。作者將CD25hiFoxp3+CD4+細胞和CD25loFoxp3+CD4+細胞（來源于未處理的DBA/1 Foxp3hCD2小鼠，hCD2作為標簽指示Foxp3表達情況）轉移到膠原誘導型關節炎（collagen-induced  arthritis  ，CIA）疾病模型小鼠上，測定臨床評分及踝關節損傷情況，發現CD25hiFoxp3+CD4+細胞與對照組及CD25loFoxp3+CD4+細胞相比減輕了關節腫脹和損傷等癥狀（圖1a，b）。將細胞經CFSE染料標記后再轉移，結果顯示在脾臟和引流淋巴結（dLNs）中CD25loFoxp3+CD4+細胞丟失了部分Foxp3的表達（30-50%）（圖1c）。由此可見， CD25loFoxp3+CD4+細胞因為丟失了Foxp3而沒有辦法緩解發炎和骨損傷癥狀。思考到這里，我忍不住想問了：丟掉Foxp3的CD25loFoxp3+CD4+細胞去哪了？

別著急，我們繼續追蹤細胞更長時間的發展， 將total Foxp3 + 、CD25hiFoxp3+CD4+和CD25loFoxp3+CD4+細胞（來源于B6.Ly5.1 Foxp3hCD2小鼠，donor）轉到C57BL/6 Ly5.2 關節炎小鼠（host）模型中，檢測Foxp3和IL17表達， CD25loFoxp3+CD4+細胞失去部分Foxp3表達，產生了更高的IL-17 （圖1d，e）。且檢測到CD25loFoxp3+ 來源的Ly5.1+Foxp3-CD4+ T細胞比naïve  CD4+ T細胞來源的有更多IL-17和CCR6的表達（兩者為TH17細胞marker）。這下清楚了，原來這些CD25loFoxp3+CD4+細胞丟失了Foxp3以后就變成我（exFoxp3 TH17細胞)了，我是從CD25loFoxp3+CD4+細胞分化而來呀。

Figure 1. CD25loFoxp3+ T cells are unstable Foxp3⁺ T cells that convert to T_H17 cells under arthritic conditions. 

第二問 我是誰

原來我是從CD25loFoxp3+CD4+細胞而來，那我到底是誰？我的祖先是誰？

CD25loFoxp3+CD4+細胞丟失Foxp3成為exFoxp3 T細胞，那我的祖先是不是exFoxp3 T細胞呢？那就跟著exFoxp3 T細胞看一看究竟吧。

百奧賽圖科普系列知識中有提到熒光報告基因小鼠有示蹤作用，本節實驗作者采用熒光標記的Foxp3-GFP-Cre小鼠與Rosa-loxp-Stop-loxp-YFP小鼠交配，GFP^-表示Foxp3^-細胞，GFP⁺表示細胞正在表達Foxp3，GFP表達之后， 同時cre酶表達與loxp位點結合將stop去除，YFP熒光表達，但如果緊接著Foxp3表達后丟失，則這部分細胞的GFP變為陰性，YFP仍表達，因此，YFP⁺則表示正在表達或者曾經表達過Foxp3^[2-3]。根據熒光表達情況可以發現，關節炎小鼠模型中GFP^-YFP⁺細胞（exFoxp3 T細胞）占CD4⁺T細胞的比例，關節處比淋巴器官高，且有選擇性的集聚在關節滑膜處（圖2a）。與GFP^-YFP^-細胞（Foxp3-CD4+ T細胞）相比，exFoxp3細胞產生更多的RANKL（轉錄因子κB受體活化因子配體）和CCR6分子（圖2b） 。IL17陽性的exFoxp3 T細胞在炎癥關節中比例最高（圖2c） 。這均表明exFoxp3 T細胞獲得了激活TH17表型（ex Foxp3 TH17細胞，這就是我啦）并聚集在發炎的滑膜中。

嗯，找到了我的祖先ex Foxp3 T細胞，那讓我來研究一下我屬于哪個部落？

exFoxp3 T細胞可能的來源有三個：tTreg細胞（胸腺來源Treg細胞）、pTreg細胞（周邊來源的T_reg細胞）、激活的傳統T細胞（表達片刻Foxp3）。Treg細胞特征性表達Foxp3并具有特異脫甲基區域，且表達一些其他標志物分子。將GFP^-YFP^-、 exFoxp3 T細胞、GFP⁺YFP⁺細胞的部分分子進行流式表達和甲基化的分析。流式數據結果顯示exFoxp3 T細胞與GFP⁺YFP⁺細胞相比，GTIR、Nrp1、KLRG1表達相近，CD25、FR4、OX40、CD39、CD103表達較低。說明exFoxp3 T細胞表達了更多的Treg 細胞marker，還是與傳統T細胞有一定區別（圖2d）。那屬于哪一類Treg細胞呢？ tTreg細胞已知其Foxp3位點是脫甲基的。作者進一步通過Foxp3、IL2rα、Ctla4序列CpG甲基化程度進行分析， exFoxp3 T細胞中Foxp3序列大部分被甲基化，Il2ra部分被甲基化（圖2e）。這一結果與已知的tTreg細胞特征有所不同。另外，基因表達分析發現exFoxp3 TH17細胞高表達優先在pTreg細胞表達的分子Cxcr5、Ccr8、Rora、Rorc（更多數據請查閱原文補充材料）；文中結合更多實驗表明ex Foxp3 TH17細胞很可能來源于pTreg細胞亞群。

Figure 2. Localization, marker gene expression and DNA methylation status of exFoxp3 T cells in arthritic mice. Results are shown from fate mapping analyses of arthritic Foxp3-GFP-Cre × ROSA26-YFP mice that were performed 2 weeks after secondary immunization. 

第三問 怎么成為我

小編：等等等等，不按邏輯出牌呢，不是應該問我要去哪么

我：去去，別打岔，我有更深刻的問題要思考，我是怎么成為現在這個樣子的？這對理解關節炎發生的機制很重要

上述實驗結果中可以發現ex Foxp3 T_H17細胞在炎癥關節中聚集，作者假設關節中存在細胞與Foxp3⁺T細胞反應，促使其轉變為T_H17細胞。設計實驗從關節炎小鼠中分離Thy1⁺CD11b^-細胞（滑膜成纖維細胞）和Thy1^-CD11b⁺細胞（滑膜巨噬細胞）與Foxp3⁺CD4⁺T細胞（從未處理的Foxp3^hCD2小鼠中分離）共同培養，Thy1⁺CD11b^-細胞下調了Foxp3⁺CD4⁺T細胞中Foxp3表達（圖3a）。將Thy1⁺CD11b^-細胞與Foxp3⁺CD4⁺T細胞或naïve CD4⁺ T細胞共同培養，檢測IL17⁺ Foxp3^-細胞比例變化及細胞因子的表達（IFN-γ、IL-4），結果顯示滑膜成纖維細胞使exFoxp3 T細胞上調了IL-17的表達水平，IFN-γ和IL-4表達沒有變化，表明滑膜成纖維細胞在關節中促使Foxp3⁺T細胞轉變為T_H17細胞。Naïve CD4⁺ T細胞沒有促使發生這一轉變。進一步研究這一轉變發生的機制，將Thy1⁺CD11b^-細胞和與Foxp3⁺CD4⁺T細胞共同培養的上清液與細胞分離分別檢測（圖3d），發現細胞并不能引起這個轉變；檢測和分析上清液的細胞因子表達，結果顯示Thy⁺CD11b^-細胞上清產生較高的IL-6因子，并在IL-17存在的情況下，IL-6表達進一步加強（圖e）。加入抗IL-6抗體抑制了exFoxp3⁺ T_H17細胞的產生。證明來源于滑膜成纖維細胞的IL-6是促使Foxp3⁺CD4⁺T細胞轉變為T_H17細胞的關鍵因素。

Figure 3. Arthritic synovial fibroblasts promote the  conversion of Foxp3⁺ T cells to T_H17 cells in an IL-6– dependent manner. . 

第四問 我有什么高(xie)超(e)的能力

破骨細胞是造成關節炎骨破壞的重要因素。為了評估TH17細胞在關節炎中對骨破壞的影響程度，作者通過破骨細胞（TRAP染色的多核細胞，TRAP⁺MNs）計數和RANKL、細胞因子表達，檢測其誘導破骨細胞生成的能力。將Foxp3hCD2小鼠與IL-17-GFP小鼠（該小鼠來源于百奧賽圖哦）交配，方便提取IL-17表達細胞。exFoxp3 TH17細胞、Foxp3+T細胞、IL17a^-/-TH17細胞分別與滑膜成纖維細胞、骨髓源肥大和巨噬前體細胞（BMMs）共同培養，結果顯示，exFoxp3 TH17細胞比TH17細胞（naïve CD4⁺T細胞來源的）具有更強的破骨細胞生成能力（圖4a,b）。 TH17細胞的誘導破骨細胞生成能力主要來自IL-17的表達，IL-17可以刺激成纖維細胞上RANKL表達， TH17細胞雖然本身也產生RANKL，但細胞自身單獨沒有辦法誘導破骨細胞生成。而IL17a^-/- exFoxp3 TH17細胞缺失IL-17A表達仍可以誘導破骨細胞生成，說明是T細胞來源的RANKL或細胞因子而不是IL-17A對破骨細胞生成有潛在影響（圖4b）。作者發現exFoxp3 TH17細胞比naïve CD4⁺T細胞來源的TH17細胞 表達了更高水平的RANKL，經過滑膜成纖維細胞共同培養，RANKL表達進一步增強。（圖4c）

如圖4d，exFoxp3 TH17細胞與BMMs共同培養，發現在沒有滑膜成纖維細胞存在的時候，exFoxp3 TH17細胞也有將BMMs誘導生成破骨細胞的能力。為了探究RANKL對exFoxp3 TH17細胞和滑膜成纖維細胞的影響，文中在共同培養系統中使用exFoxp3 TH17細胞（從Lck-cre（T淋巴細胞特異cre小鼠） Tnfsf11（編碼RANKL）flox/△ Foxp3hCD2 小鼠中分離）或Tnfsf11缺失的滑膜成纖維細胞。結果表示RANKL的表達是滑膜成纖維細胞促使破骨細胞生成的關鍵因素，而在沒有表達RANKL的滑膜成纖維細胞存在下，exFoxp3 TH17細胞中RANKL的表達也能夠促使破骨細胞生成（圖4e，f）。

用GeneChip分析exFoxp3 TH17細胞和TH17細胞（naïve CD4⁺T細胞來源的），相比之下，exFoxp3 TH17細胞表達了更高的Ccr6、Ccl20、Il23r，Il17re，Tnfrsf21，Vcam1，Rorc和Tnfsf11，較低的Csf2，Tnf，Il10和Sgk1。結果說明exFoxp3 TH17細胞與多數已知的致病性的TH17細胞亞群并不相同，組成一種新的致病性TH17細胞亞群。

看看，同樣都是TH17細胞，我是exFoxp3 TH17細胞，我的祖先是exFoxp3 T細胞，通過獲得了激活TH17變化而來的，跟其他TH17細胞就是不一樣哦!  （高唱：“我們不一樣！”）

Figure 4. exFoxp3 T_H17 cells are osteoclastogenic T cells with distinct gene profiles. 

第五問 我的家族在關節炎中有哪些“貢獻”

我的祖先是exFoxp3 T細胞，來自CD25loFoxp3+CD4+ T細胞家族，我們家族好像很厲害的樣子呢，讓我們一起來看一看它們對關節炎有哪些“貢獻”吧。

胸腺來源的穩定的Foxp3+CD4+ T細胞與自身抗原有較高的親和力，維持了自身耐受性。作者假設不穩定的Foxp3+CD4+T細胞也包含自我反應T細胞，并且在失去Foxp3表達之后導致關節炎發生。為了研究自身抗原特異性的exFoxp3 T細胞的作用，作者將CD25loFoxp3+、 CD25hiFoxp3+、Foxp3-、效應記憶CD44hiFoxp3-CD4+T細胞（來源于膠原免疫的DBA/1 Foxp3hCD2小鼠）標記CFSE，轉移到免疫小鼠模型中， CD25loFoxp3+細胞加速了關節炎發生，加重了癥狀。關節炎條件下，自身反應CD4+ T 細胞主要來源于CD25loFoxp3+CD4+ T細胞（圖5a-c）。相比，CD25hiFoxp3+細胞顯著抑制了破骨細胞的生成，幾乎一半的CD25loFoxp3+細胞失去了Foxp3表達，幾乎全部CD25hiFoxp3+細胞仍表達Foxp3（圖5d）。體外二型膠原刺激后， CD25loFoxp3+細胞開始增殖，表明其包含更多的自身反應T細胞（圖5e）。

Figure 5. Pathogenic role of exFoxp3 T cells to arthritis in vivo. 

場景：關節炎

主人公： ex Foxp3 T_H17細胞

我是ex Foxp3 T_H17細胞，屬于pT_reg細胞部落，從CD25loFoxp3+ CD4+ T細胞丟失Foxp3表達，聚集到關節，經滑膜成纖維細胞產生的IL-6轉變而來。表達Ccr6、CCL20、IL23R、RANKL是我的標志，有較強的促破骨細胞發生能力，在關節炎的病理中有比較關鍵的作用。希望通過我的獨白大家能夠了解自身免疫關節炎中的發生機制和關鍵角色，我也能成為RA的標志物，預測抗IL-6抗體的治療效果，進而發展成為自身免疫疾病的新的治療手段。

本篇文章作者充分利用了基因編輯小鼠研究了自身免疫疾病的部分發生機制。很榮幸百奧賽圖起家第一桶金的產品鼠的IL-17a GFP KI小鼠對文章的研究有所幫助，如果您需要購買該小鼠或制備屬于您的專屬科研小鼠，請與我們聯系哦！

參考文獻：

1. Komatsu, N., Okamoto, K., Sawa, S., Nakashima, T., Oh-hora, M., Kodama, T., … Takayanagi, H. (2013). Pathogenic conversion of Foxp3+ T cells into TH17 cells in autoimmune arthritis. Nature Medicine, 20(1), 62–68.

2. Zhou, X., Jeker, L. T., Fife, B. T., Zhu, S., Anderson, M. S., McManus, M. T., & Bluestone, J. A. (2008). Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine, 205(9), 1983–1991. 

3. Zhou, X., Bailey-Bucktrout, S. L., Jeker, L. T., Penaranda, C., Martínez-Llordella, M., Ashby, M., … Bluestone, J. A. (2009). Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in vivo. Nature Immunology, 10(9), 1000–1007.