SMAD2/3與TGF-β通路協同影響轉錄因子發生m6A RNA甲基化調控干細胞發育
Nature | SMAD2/3與TGF-β通路協同影響轉錄因子發生m6A RNA甲基化調控干細胞發育
文章導讀：
胚胎干細胞作為一種全能性細胞，通過增殖和分化，產生動物體所有組織和器官的細胞。已有研究表明，胚胎干細胞發生m6A RNA甲基化，大多與細胞增殖[1-2]，免疫應答[4]關系密切。然而，對于m6A修飾在胚胎干細胞向神經內胚層細胞分化過程中的分子機制目前并沒有相關報道。今天，分享一篇英國劍橋大學研究團隊于2018年8月發表在Nature（影響因子：40.14）文章，聊一聊RNA甲基化在調控胚胎干細胞分化過程中的作用機制。這篇文章的開頭很直接，首先通過閱讀文獻確定了感興趣的基因SMAD2/3，對其進行Co-IP和質譜后，結果顯示其能夠與甲基化轉移酶METTL3，METTL14和WTAP直接互作。他們是明星，和他們結合的分子也是明星分子，這不，在胚胎干細胞當中有研究者就發現SMAD2/3就和METTL3，METTL14結合，不出所料，這一結合在胚胎干細胞當中起到了重要作用。
胚胎干細胞作為一種全能性細胞，通過增殖和分化，產生動物體所有組織和器官的細胞。已有研究表明，胚胎干細胞發生m6A RNA甲基化，大多與細胞增殖[1-2]，免疫應答[4]關系密切。然而，對于m6A修飾在胚胎干細胞向神經內胚層細胞分化過程中的分子機制目前并沒有相關報道。今天，分享一篇英國劍橋大學研究團隊于2018年8月發表在Nature（影響因子：40.14）文章，聊一聊RNA甲基化在調控胚胎干細胞分化過程中的作用機制。這篇文章的開頭很直接，首先通過閱讀文獻確定了感興趣的基因SMAD2/3，對其進行Co-IP和質譜后，結果顯示其能夠與甲基化轉移酶METTL3，METTL14和WTAP直接互作。他們是明星，和他們結合的分子也是明星分子，這不，在胚胎干細胞當中有研究者就發現SMAD2/3就和METTL3，METTL14結合，不出所料，這一結合在胚胎干細胞當中起到了重要作用。
欲知詳情，讓我們接著往下看。
文章內容：
1.SMAD2/3蛋白與METTL3-METTL14-WTAP復合物結合
作者首先通過體外刺激，誘導人類胚胎干細胞分化為神經外胚層細胞，并通過Co-IP技術聯合質譜（云序生物提供此項實驗）技術，對比兩種細胞中，能夠與SMAD2/3抗體直接結合的蛋白。結果顯示，一共找到89個蛋白，取交集后，得到78個共有蛋白，繪制成網絡圖，發現這些蛋白除參與TGF-β信號通路，mRNA生物學過程之外，還與國自然大熱點RNA甲基化中的甲基化轉移酶-------METTL3-METTL14-WTAP復合物直接互作。此結果與后期WB驗證和抑制SMAD2/3磷酸化位點后Co-IP結果吻合。PLA實驗證實兩者間的結合主要發生在細胞核內，并且受Activin刺激后，影響核內轉錄因子NANOG表達。
1.SMAD2/3蛋白與METTL3-METTL14-WTAP復合物結合
作者首先通過體外刺激，誘導人類胚胎干細胞分化為神經外胚層細胞，并通過Co-IP技術聯合質譜（云序生物提供此項實驗）技術，對比兩種細胞中，能夠與SMAD2/3抗體直接結合的蛋白。結果顯示，一共找到89個蛋白，取交集后，得到78個共有蛋白，繪制成網絡圖，發現這些蛋白除參與TGF-β信號通路，mRNA生物學過程之外，還與國自然大熱點RNA甲基化中的甲基化轉移酶-------METTL3-METTL14-WTAP復合物直接互作。此結果與后期WB驗證和抑制SMAD2/3磷酸化位點后Co-IP結果吻合。PLA實驗證實兩者間的結合主要發生在細胞核內，并且受Activin刺激后，影響核內轉錄因子NANOG表達。
2.Activin/Nodal影響SMAD2/3下游轉錄因子甲基化
作者以Activin/Nodal敲降組胚胎干細胞為實驗組，未敲降組為對照，每組三個生物學重復，進行m6A RNA甲基化測序(云序生物提供此項實驗）。結果顯示，motif區域保守序列為GGAC，且大多在轉錄起始區和轉錄終止區富集，Activin/Nodal特有甲基化位點在轉錄起始區低富集。可視化結果顯示，NANOG和LEFTY1的mRNA分子上存在m6A甲基化信號（如紅框所示）,并且通過SMAD2/3的ChIP測序（云序生物提供此項實驗）結果，有一部分區域與甲基化信號重疊（如綠框所示）。WTAP或SMAD2/3蛋白RIP實驗（云序生物提供此項實驗）證實，在受Actin分子刺激下，WTAP與NANOG，LEFT，FZD8和NOC2L結合增強，而在SMAD2/3分子刺激下，能夠促進其降解。
作者以Activin/Nodal敲降組胚胎干細胞為實驗組，未敲降組為對照，每組三個生物學重復，進行m6A RNA甲基化測序(云序生物提供此項實驗）。結果顯示，motif區域保守序列為GGAC，且大多在轉錄起始區和轉錄終止區富集，Activin/Nodal特有甲基化位點在轉錄起始區低富集。可視化結果顯示，NANOG和LEFTY1的mRNA分子上存在m6A甲基化信號（如紅框所示）,并且通過SMAD2/3的ChIP測序（云序生物提供此項實驗）結果，有一部分區域與甲基化信號重疊（如綠框所示）。WTAP或SMAD2/3蛋白RIP實驗（云序生物提供此項實驗）證實，在受Actin分子刺激下，WTAP與NANOG，LEFT，FZD8和NOC2L結合增強，而在SMAD2/3分子刺激下，能夠促進其降解。
3.Activin/Nodal促進SMAD2/3結合蛋白與下游轉錄因子結合
前人研究證實m6A多在細胞核內促進pre-RNA的合成，由于本實驗的SMAD2/3通過與m6A 甲基化酶復合物結合，影響靶基因合成的位置同樣也在核內，并且SMAD2/3的轉錄和甲基化受Activin/Nodal調控，因此，作者猜測SMAD2/3可能參與pre-mRNA的合成。通過抑制Activin/Nodal后檢測m6A RNA甲基化水平，發現差異甲基化的情況不單單在外顯子上下調，同時在外顯子和內含子交界處受抑制。綜上，Actin通過促進磷酸化的SMAD2/3蛋白與下游轉錄因子結合，調控靶基因發生m6A RNA甲基化。
前人研究證實m6A多在細胞核內促進pre-RNA的合成，由于本實驗的SMAD2/3通過與m6A 甲基化酶復合物結合，影響靶基因合成的位置同樣也在核內，并且SMAD2/3的轉錄和甲基化受Activin/Nodal調控，因此，作者猜測SMAD2/3可能參與pre-mRNA的合成。通過抑制Activin/Nodal后檢測m6A RNA甲基化水平，發現差異甲基化的情況不單單在外顯子上下調，同時在外顯子和內含子交界處受抑制。綜上，Actin通過促進磷酸化的SMAD2/3蛋白與下游轉錄因子結合，調控靶基因發生m6A RNA甲基化。
4.轉錄因子mRNA甲基化負調控干細胞增殖
通常來說，RNA甲基化與基因的表達關系密切。作者接下來分析了甲基化與轉錄水平的兩組學聯合分析，發現下調Activin/Nodal通路后，NNANOG上的m6A甲基化水平與表達量成反比，并對神經內胚層分化起促進作用。
通常來說，RNA甲基化與基因的表達關系密切。作者接下來分析了甲基化與轉錄水平的兩組學聯合分析，發現下調Activin/Nodal通路后，NNANOG上的m6A甲基化水平與表達量成反比，并對神經內胚層分化起促進作用。
總結
本篇文章首次研究了SMAD2/3蛋白與TGF-β通路間復雜的細胞內生物學過程。本文結果展示了SMAD2/3在mRNA上發揮了調控，凋亡，DNA修復和轉錄后調控的生物學功能，并闡述了此過程受Activin/Nodal的m6A甲基化調控，并與甲基化轉移酶間的關聯。本文為以后研究RNA甲基化非經典機制，如與染色質表觀遺傳、轉錄和表位調控奠定基礎。
本篇文章首次研究了SMAD2/3蛋白與TGF-β通路間復雜的細胞內生物學過程。本文結果展示了SMAD2/3在mRNA上發揮了調控，凋亡，DNA修復和轉錄后調控的生物學功能，并闡述了此過程受Activin/Nodal的m6A甲基化調控，并與甲基化轉移酶間的關聯。本文為以后研究RNA甲基化非經典機制，如與染色質表觀遺傳、轉錄和表位調控奠定基礎。
全文鏈接
https://www.nature.com/articles/nature25784
參考文獻
1.Yang D, Qiao J, Wang G, et al. N6-Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential[J]. Nucleic Acids Research, 2018, 46. 影響因子：11.561
2.Wen J, Lv R, Ma H, et al. Zc3h13 Regulates Nuclear RNA m6A Methylation and Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal.[J]. Molecular Cell, 2018, 69(6):1028. ?影響因子: 14.248
3.Li H B, Tong J, Zhu S, et al. m6A mRNA methylation controls T cell homeostasis by targeting the IL-7/STAT5/SOCS pathways[J]. Nature, 2017, 548(7667):338-342. 影響因子: 41.577?
1.Yang D, Qiao J, Wang G, et al. N6-Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential[J]. Nucleic Acids Research, 2018, 46. 影響因子：11.561
2.Wen J, Lv R, Ma H, et al. Zc3h13 Regulates Nuclear RNA m6A Methylation and Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal.[J]. Molecular Cell, 2018, 69(6):1028. ?影響因子: 14.248
3.Li H B, Tong J, Zhu S, et al. m6A mRNA methylation controls T cell homeostasis by targeting the IL-7/STAT5/SOCS pathways[J]. Nature, 2017, 548(7667):338-342. 影響因子: 41.577?
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