中國微生物菌種查詢網  在抗體研究的漫長過程中,相繼發展了三代不同水平的抗體制備技術｡其中以抗原免疫高等脊椎動物制備的多克隆抗體,稱為第一代抗體;通過雜交瘤技術生產的只針對某一種特定抗原決定簇的單克隆抗體,稱為第二代抗體;應用重組DNA技術或是基因突變的方法改造某種抗體基因的編碼序列,使之產生出自然界中原本存在的抗體蛋白質分子叫做基因工程抗體,即第三代抗體｡這種基因工程稱為抗體工程｡
Kohler等于1975年創立的B淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術,使抗體技術的研究和應用有了重大突破｡該技術已在疾病的研究､診斷､治療中得到了廣泛的應用｡盡管如此,單克隆抗體作為異種蛋白,應用于機體會受到免疫系統的限制,產生強烈的免疫應答｡另外,雜交瘤技術還有許多不足之處,如生產的單抗分子體積過大,與靶抗原的親和力不夠,不同的抗原需要單獨接種單抗,細胞融合技術難度高､效率低｡最主要的是,單克隆抗體應用于人體疾病治療時,使用單抗兩周內就會對其產生免疫反應｡這使得傳統單克隆抗體技術制備的抗體在應用上受到了極大的制約,無法充分發揮其在疾病防控方面的作用｡因此,基因工程技術及抗體分子遺傳學應運而生,并得到了進一步的發展｡在20世紀80年代中期出現新技術將免疫球蛋白的基因結構和功能同DNA重組技術結合起來,再將重組后的免疫球蛋白分子基因導入細胞進行表達｡由該技術所得的抗體去除或減少了無關結構,保留(或增加)了天然抗體的特異性和生物學活性,降低或基本消除抗體的免疫原性,減低抗體中鼠源成分的同時保留原有抗體的特異性｡對現有的優良鼠單抗基因進行改造,所得的抗體人源化程度高,生產工藝簡單,廉價易得,且容易獲得稀有抗體,臨床應用前景廣闊｡
1984年,Morrison等創立了鼠/人嵌合抗體技術,該技術使得基因工程抗體技術得到了進一步的發展｡在第三代抗體中主要包括人源化抗體､小分子抗體､抗體融合蛋白及某些特殊類型抗體等,從一定程度克服了前兩代抗體技術的不足｡另外,噬菌體抗體庫､核糖體展示文庫等的構建使得不經抗原免疫就可獲得特異性抗體｡
1､人源化的基因工程抗體
人們早期曾嘗試用人雜交瘤細胞來生產人單克隆抗體,但是由于人雜交瘤細胞的不穩定性､人單克隆抗體的低親和力和倫理爭議等方面的原因導致該技術很少被應用｡
1.1､嵌合抗體
降低鼠源單克隆抗體免疫原性的一種方法是將鼠免疫球蛋白的可變區部分鏈接到相應的人免疫球蛋白的恒定區,這樣就產生了鼠/人嵌合抗體,人源區域在60%~70%｡應用重組DNA技術,將鼠源單抗的可變區基因與人的恒定區基因連接,構建的嵌合基因插入適當的表達質粒,轉染相應的細胞后表達｡所產生的嵌合抗體具有結合抗原的功能,同時降低了鼠源單抗的異源性,這樣的嵌合抗體在親和力方面與相應的鼠單抗沒有太大的差異,而人對它的免疫反應會有所降低｡但由于其仍然保留了鼠免疫球蛋白可變區的異源性,臨床實驗證明該嵌合抗體在應用時還會產生人抗嵌合抗體(HACA)可變區的免疫反應｡
1.2､人化抗體
為了降低嵌合抗體的免疫原性,使嵌合抗體更加人源化,產生了CDR嫁接技術｡該技術將免疫球蛋白的其他區域都用人免疫球蛋白取代,而僅僅保留鼠免疫球蛋白可變區的CDR部分,這就最大限度地降低鼠源抗體的免疫原性｡這樣產生的抗體叫做人化抗體或改形抗體｡這樣的操作往往需要復雜的DNA操作,并且有些病人也會產生針對異源CDR的免疫反應｡為了降低這種反應,只有CDR中最具特異性的氨基酸殘基部分才能被嫁接到人抗體的骨架部分｡盡管抗體的親和力主要取決于CDR,但是抗體的其他部分也會對親和力產生影響｡為了在免疫球蛋白改形后仍然保持原有的親和力,還需要對免疫球蛋白骨架區進行改進｡
2､小分子抗體
為了突破單克隆抗體過大帶來的限制,發展了小分子抗體的技術｡這些技術的目標是獲得抗體的抗原結合片段(Fab)和抗體的可變區(Fv)｡這樣的片段可以通過對抗體的裂解得到,也可以通過擴增免疫球蛋白的相關基因并在細菌內克隆表達而得到｡小分子抗體分子量小､穿透性強､免疫原性低､半衰期短,目前研究較多和比較有實用前景的有以下幾種｡
2.1､單鏈抗體(scFv)
該技術將重鏈可變區與輕鏈可變區用一連接肽連接,并利用原核表達系統表達成一條單鏈多肽并折疊成由重鏈､輕鏈可變區構成的一種新型抗體｡該抗體大小僅為完整IgG的1/6,同時抗原結合位點沒有發生變化,因此保留了完整的結合特異性｡基于這一優勢,ScFv具有更好的組織穿透力,能夠進入一般抗體無法到達的部位,在臨床應用及疾病治療中能夠得到更好的應用｡另外,單鏈抗體擁有多肽接頭,可根據需要設計為具有特殊功能的位點,如金屬鰲合､連接毒素或藥物等,用于影像和臨床治療｡
2.2､多價抗體
該抗體的多個抗原結合位點具有不同的特異性,能夠結合不同的抗原分子,改變了傳統抗體只能結合單一抗原分子的不足｡目前研究人員關注較多的是雙特異性單克隆抗體(BsAb)｡應用基因工程與化學偶聯技術,把識別不同抗原的兩種抗體的編碼序列進行重新排列,生產出可同時與兩種抗原作特異性結合的新型重組抗體,即雙特異性單克隆抗體｡在這種抗體中,兩條臂分別識別兩種不同的抗原,因此構建出既能同腫瘤細胞表面抗原結合,又能同殺傷性T細胞表面抗原結合的雙特異性的單克隆抗體｡這使兩種不同的細胞彼此靠近,從而有利于殺傷性T細胞對腫瘤細胞的致死作用｡
2.3､Fab片段
在抗體中,Fab段主要起到結合抗原的作用,而利用基因工程的方法,將Fd基因與輕鏈基因5′端通過鏈間二硫鍵連接,并接上細菌的信號序列｡表達后的蛋白在信號肽酶的作用下被剪除信號肽并完成立體折疊等步驟成為異二聚體,發揮正常Fab的功能｡該抗體僅為IgG的1/3,且沒有Fc段,免疫原性低,具有良好的穿透力,常用作導向藥物的載體和顯影｡
3､噬菌體抗體技術
20世紀90年代初,在PCR技術､抗體Fab片段在大腸桿菌中的表達及噬菌體表面呈現技術快速發展的基礎上,出現了基于分子生物學方法建立的抗體庫技術｡其中,噬菌體抗體庫技術表現更為優越｡
噬菌體抗體(PhAb)技術的基本程序是:用PCR方法擴增全套抗體可變區基因或抗體片段(Fab､Fv或scFv)基因,并與噬菌體衣殼蛋白基因連接后轉入載體中,它能夠與絲狀噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白,將抗體Fab段或單鏈抗體表達在噬菌體表面,然后通過抗原的親和篩選從眾多的抗體中得到特異性明確的抗體及其編碼基因｡該技術繞過細胞雜交環節,不再使用小鼠進行免疫得到抗體,在數周內就能夠得到特異的人抗體基因而生產人源化抗體｡用B淋巴細胞全套抗體可變區基因克隆并組裝成的噬菌體群體稱之為噬菌體抗體庫｡根據抗體片段大小的不同,抗體庫可分為Fab庫､單鏈抗體(scFv)庫､單域抗體庫､diabody庫､dsFv庫和minibody庫等｡scFv和單域抗體分子小､穿透力強､體內半衰期短､免疫原性低｡diabody與minibody都是雙價抗體,其與抗原的結合能力遠高于單鏈抗體,是較理想的免疫顯像和治療用抗體形式｡
該技術操作簡單､無需細胞雜交或復雜的PCR技術､周期短､花費少;利用不同的抗原可同時篩選幾種抗體,并可在百萬至億萬個分子中進行選擇;適用于抗體､激素､酶､藥物､隨機多肽等蛋白的制備,更為令人關注的是,該技術能得到由于免疫耐受機制的影響導致免疫動物不能產生的抗體｡噬菌體抗體技術極大地推動了基因工程抗體的發展,它們的產生為人類及動物疾病的預防､診斷和治療帶來了新的希望｡
4､核糖體展示技術與mRNA展示技術
核糖體展示技術的關鍵步驟在于,利用分子生物學技術構建ScFv抗體基因文庫,然后轉錄成mRNA;在大腸桿菌等體外表達系統中翻譯､表達,最終以固化的抗原進行親和篩選,從翻譯后的mRNA-ScFv復合物中得到高親和力的ScFv｡改進后的RD技術,由于mRNA上沒有任何終止密碼子,翻譯過程中蛋白和編碼它的mRNA同時結合在核糖體上,形成了蛋白-mRNA-核糖體復合物,使得蛋白的表型及基因型以這種復合物的形式偶聯,經過展示后,篩選蛋白能夠被富集100~1000倍｡該技術不使用任何細胞,因此相較于其他技術,效率得到了明顯的提高,極大的縮短了實驗周期,便捷､快速｡
1997年Roberts等設計了一種與RD類似的方法,即mRNA展示技術(mRNAdisplay,又稱RNA-多肽融合技術,RNA-peptidefusion)｡該系統利用嘌呤霉素分子將mRNA分子與其所編碼的多肽共價結合起來,先將嘌呤霉素與單鏈DNA連接物的3′端連結,再與文庫編碼的mRNA連結｡這樣,當mRNA在體外翻譯時,核糖體到達mRNA和DNA的結合點并穩定下來,嘌呤霉素進入核糖體氨酰化位點,在氨酰轉移酶的作用下與所編碼的多肽偶聯,再用固化的抗原分子對RNA-多肽復合物進行篩選｡
5､轉基因動物技術
近年來,轉基因動物技術飛速發展,其應用范圍也越來越廣｡例如,鼠胚胎干細胞的IgH和Igκ位點在利用同源性重組技術刪除JH和Cκ區而滅活后,能夠達到宿主動物相應基因沉默的目的｡分別刪除這兩個區域的小鼠雜交而得的后代JH-/-和Cκ-/-兩基因被滅活,然后將人抗體基因克隆到酵母人工染色體上,并整合入該種小鼠的胚胎細胞,這樣的細胞經顯微注射入母體后得到含人抗體IgH和Igκ位點序列的雜交后代｡經免疫后,這些雜交鼠產生的人源抗體親和力高,特異性好,使用效果及安全性得到了較大的提高,對自身免疫性疾病､癌癥等慢性病的治療效果優異｡ 
6､轉基因植物技術
與哺乳動物細胞系或轉基因動物產生抗體比較,植物抗體(Plantibody)具有價廉､高效､安全等優點｡1995年Ma等制備了一種產生于煙草植物中的抗體———分泌型二聚體IgA/G(SIgA/G),能識別變異鏈球菌細胞表面蛋白｡經研究證明,該抗體可用于治療齒齲病,還可防止變異鏈球菌定居口腔,效用可持續4個月｡2002年,Bouquin等在轉基因芥類植物細胞中成功制備了抗RhD抗原的人源化IgG1抗體,經研究表明該抗體具有廣闊的診斷及治療應用前景｡
抗體制備技術在基因工程抗體技術的發展過程中進入了一個全新的時代,可廣泛應用于生命科學中的許多領域,對于病毒性疾病､器官移植､腫瘤､自身免疫性疾病､中毒性疾病､變態反應性疾病等方面具有重要的作用｡這些技術使制備抗體變得簡單便捷､穩定廉價,為大規模的應用提供了良好的基礎｡另外,所得的抗體在蛋白質純化工程中也能夠得到廣泛的應用｡隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發展,基因工程抗體技術將在疾病預防､診斷及治療上得到越來越多的應用,這為提高人類生活質量提供強有力的支持｡