實驗原理：

抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性，免疫組織化學正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質。由于抗原與抗體的復合物是無色的，因此還必須借助于組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯示出來，以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究。

實驗材料：

（一）儀器設備

18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐、水浴鍋

（二）試劑

1、PBS緩沖液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L、KCl 2.7mmol/L 、Na2HPO4 4.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L。

2、0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,ph6.0,1000ml）：檸檬酸三鈉3g、檸檬酸0.4g。3、0.5mol/L EDTA緩沖液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH調至ph8.0，加水至1000ml。

4、1mol/L的TBS緩沖液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至ph8.0, 加水1000ml。

5、 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6、3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7、風裱劑：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制

8、TBS/PBS PH9.0–9.5，適用于熒光纖維鏡標本；ph7.0-7.4適合光學纖維標本。

實驗步驟：

（一）脫蠟和水化：

脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

1、 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘。

2、無水乙醇中浸泡五分鐘。

3、 95%乙醇中浸泡五分鐘。

4、75%乙醇中浸泡五分鐘。

（二）抗原修復：

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：

1、抗原熱修復

（1）高壓熱修復在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m檸檬酸鈉緩沖溶液（ph6.0）。蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。

（2）沸熱修復電爐或水浴鍋加熱0.01檸檬酸鈉緩沖液（ph6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。

（3）微波爐加熱在微波爐里加熱0.01檸檬酸鈉緩沖液（ph6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復1-2次。適用的抗原Bcl-2、ax、AR、PR、C-fos、x-jum、z-kit、c-myc、E-cadherin。ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshock、Protein、HPV、Ki-67、MDMZ、P53、P34、P15、P-glycoprotein、PKC、PCNA、ras、Rb等

2、酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37℃，消化時間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen、GFAP、Complement、Cytokeratin、C-erB-2、LCA、LN等。

（三）免疫組化染色SP法

1、脫蠟、水化。

2、PBS洗2-3次各5分鐘。

3、3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘。

4、PBS洗2-3次各5分鐘。

5、抗原修復。

6、PBS洗2-3次各5分鐘。

7、滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。

8、滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時。

9、4℃過夜后需在37℃復溫45分鐘。

10、PBS洗3次每次2分鐘。

11、滴加Ⅱ抗45-50μl,室溫靜置或37℃1小時。

12、Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20。

13、PBS洗3次各5分鐘。

14、DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度。

15、PBS或自來水沖洗10分鐘。

16、蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化。

17、自來水沖洗10-15分鐘。

18、脫水、透明、封片、鏡檢。

（四）SABC法

1、脫蠟、水化 。

2、PBS洗2次各5分鐘。

3、用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次（4）抗原修復。

4、PBS洗5分鐘。

5、滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。

5、滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時。

6、PBS洗3次各2分鐘。

7、滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘。

8、PBS洗3次各2分鐘。

9、滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘。

10、PBS洗4次各5分鐘。

11、DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色。

12、脫水、透明、封片、鏡檢。

免疫組化問題解答

1、染色過強

 a 抗體濃度過高戒孵育時間過長 。降低抗體滴度、抗體孵育時間：室溫1小時、或4度過夜

 b 孵育溫度過高超過37度。 一般在室溫20-28度 c DAB顯色時間過長戒濃度過高 顯色時間不超過5-12分鐘，以顯微鏡下觀察為準。

2、非特異性背景染色

a 操作過程中沖洗不充分 ：每步沖洗3次每次5分鐘。

b 組織中含過氧化物酶未阻斷：可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時間延長。

c 組織中含內原性生物素：正常非免疫動物血清再封閉。

d 血清蛋白封閉不充分：延長血清蛋白封閉時間。

3、染色弱

a 抗體濃度過低、孵育時間過短：提高抗體濃度、孵育時間不能少于60分鐘。

b 試劑超過有效使用時間：應更換試劑。

c 操作中添加試劑時緩沖液未瀝干：每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液使試劑稀釋（應防止切片干燥）。

d 室溫太低：低于15度，要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘，或4度冰箱過夜。

e蛋白封閉過度：封閉不要超過12分鐘。

4、染色陰性

a 操作步驟錯誤：應重試、設陽性對照。

b 組織中無抗原：設陽性對照以驗證試驗結果。

c 一抗不二抗種屬連接錯誤：仔細確定一抗二抗種屬無誤。

 

免疫組化操作要點及技巧

1、固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。

Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的長期保存。

PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。

2、組織脫水，透明：時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整。

3、切片時展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當地在水中加入幾滴乙醇。

4、烤片：60℃ 30分鐘戒37℃ 過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。

5、蠟塊及切片的保存：最好在4℃保存 。

6、脫片問題：

Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進行下一步。

7、滅活內源性酶：HRP系統：3%雙氧水滅活；AP系統：3%HAc滅活。

8、暴露抗原：對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強度(不同抗體的最佳修復液請參閱抗體說明書)。對不同組織，不同抗原，不同的抗體，所采用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

9、封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時或用濃縮血清封閉

10、抗體稀釋：應遵循“現用現配”的原則，對亍PBS稀釋的抗體一定要當天使用。

11、背景高：在抗體濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色前要多洗。

12、返藍：在蘇木素復染后，可用堿性緩沖液（如PBS）戒Na2HPO4的飽和溶液返藍。

13、顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。

14、在整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。

15、拍照

1)更換樣品時，除了調整焦距和規野外，顯微鏡上的其他部件都不能動！所有樣品必須一次拍攝完全。特別是在拍攝過程中，不要一會用高倍鏡，一會用低倍鏡，來回切換物鏡。

2)數碼相機必須設置為手動曝光，并且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時間，同樣的光圈。特別要注意的是，一定要將數碼相機的自動白平衡功能給關掉 。

3)免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應盡可能呈現純白色。測量其灰度應在250左右。如果呈現淡藍色，一般是相機自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍。

免疫組化技術的關鍵問題

1.組織處理

恰當的組織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內部因素，在組織細胞材料準備過程中，不僅要求保持組織細胞形態完整，更要保持組織細胞的抗原性不受損戒彌漫，防止組織自溶。如果出現自溶壞死的組織，抗原已經丟失，即使用很靈敏的檢測抗體和高超的技術，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死及制片時的刀痕擠壓，在上述區域易出現假陽性結果。

1) 組織及時取材和固定

組織標本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應盡快的進行材，最好2h內，取材時所用的刀應銳利，要一刀下去切開組織，不可反復切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，(也就是說組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊厚度千萬不能超過0.2cm，否則將不利于組織的均勻固定)。固定液快速滲透到組織內部使組織蛋白能在一定時間內迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細胞形態。

對亍固定液的選擇，原則上講，應根據抗原的耐受性來選擇相應的固定液，但除非是與項科研項目，在病理常見工作很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常見HE病理診斷的基礎上決定是否進行免疫組化的染色，而HE染色的常見組織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進行組織固定，利用其滲透性強，對組織的作用均勻進行固定，但組織固定時間最好在l2h內，一般固定時間不應超過24小時。隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。

2) 組織脫水、透明、浸蠟

組織經固定后迚行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織癿硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無水酒精脫水和二甲苯透明的時間不宜過長，正常大小的組織無水酒精脫水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過65℃。

2.切片

組織得到很好處理后在進行切片前還應對玻璃片進行處理，由亍我們檢測抗原是多種多樣的，因染色操作程序復雜，時間較長，有些抗原是要進行各種抗原修復處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證克免疫組化實驗的正常迚行，要求在貼片前對載玻片作適當處理，必須在清洗干冷的玻片上進行粘合劑癿處理以防脫片。

1)Poly-L-Lysine (多聚左旋賴氨酸) 一般采用分子量30000左右癿0.5%多聚賴氨酸最好，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優點是可以用于多種組織化學、免疫組化及分子學檢測中的應用，粘貼效果最好，但價格稍貴。

2)明膠硫酸鉻鉀法

將2.5g明膠加熱溶亍500ml蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2 min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價格便宜、方法簡單，任何實驗都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應注意，如果液體發藍戒粘稠狀停用。

3)APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)

此法必須現用現配。將洗冷玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮戒蒸餾水中刷去末結合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現氣泡。

切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片在進行免疫組化染色都將出現假陽性現象，切片厚度一般為3-4μm，切好的切片在60℃溫箱中過夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細胞結構破壞，而產生抗原標記定位彌漫現象。

3.免疫組化染色

S-P免疫組化染色試劑盒采用生物素標記癿第二抗體不鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測定細胞和組織中的抗原。

S-P免疫組化染色步驟：

石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH7．4)沖洗三次，每次3分鐘(3×3’)。

2) 根據每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復。

3) 每張切片加1滴或50ul過氧化酶阻斷溶液(試劑A)，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10分鐘。

4) PBS沖洗3×3’。

5) 甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul的非免疫性動物血清(試劑B)，室溫下孵育10分鐘。

6) 甩去血清，每張切片加1滴或50ul的第一抗體(用戶自選)，室溫下孵育60分鐘戒4℃過夜，建議參閱每種抗體的說明書。

7) PBS沖洗3×5’。

8) 甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul生物素標記的第二抗體（試劑C），室溫下孵育10分鐘。

9) PBS沖洗3×3’。

10)甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10分鐘。

11)PBS沖洗3×3’。

12)甩去PBS液，每張切片加2滴或100ul新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。

13)自來水沖洗，蘇木素復染，0.1％HCL分化，0.1％氨水或PBS沖洗返藍。

14)如果用DAB顯色，則切片經過梯度酒精脫水干燥，(二甲苯透明)，中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。

免疫組化染色注意事項

免疫組化染色方法已不是什么很難的問題，操作步驟簡單也易掌握，但要染好免疫組化，其中方法的技巧將是每位操作者在實際工作中不斷摸索和探討的事，但最基本的應從以下方面加以注意：

（1）去除內源酶及內源性生物素

一般我們進行免疫組化標記的都是一些生物體組織，其中自身含有一定量的內源酶和內源性生物素，而免疫組化各種染色大部分是用過氧化物酶來標記抗體癿，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，而組織中的內源性酶同樣也能催化底物，使其顯色，這就影響免疫組化的特異性，所以在標記抗體的過氧化酶進行人組織切片之前就應設法將組織內的內源性各種酶滅活，以保證免疫組化染色在特異性情況下進行。

1) 去除內源酶

常用的去除內源性酶的方法是3%過氧化氫水溶液。但在含有豐富血細胞的標本中，由于其中含有大量的具有活性的過氧化物酶，能不過氧化氫反應，出現氣泡現象，易對組織結構和細胞形態產生一些不良影響，但用3%過氧化氫的方法，能夠去除大部分內源性酶，即使有些血細胞在顯色后也出現棕黃色反應，但由于其形態結構不組織細胞不同，也易鑒別，而此方法比較通用易操作，但應注意過氧化氫的濃度不能過高，一般為3%一5%，時間不宜過長，最好室溫10min。

2) 去除內源性生物素

在正常組織細胞中也含有生物素，特別是肝、脾、腎、腦，皮膚等組織中，在應用親和素試劑的染色中，內源性生物素易結合卵白素，形成卵白素一生物素復合物，導致假陽性，所以在采用生物素方法染色前也可以將組織切片進行0.01%卵白素溶液室溫處理20min，使其結合位點飽和，以消除內源性生物素的活性。

3）滅活堿性磷酸酶

最常用的方法是將左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值為7.6-8.2，能除去大部分內源性堿性磷酸酶，對亍仍能干擾染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。

（2）抑制非特異性背景著色

非特異性著色最常見的情況是抗體吸附到組織切片中高度荷電的膠原和結締組織成分上，而出現背景著色，為了防止這種現象，最好用特異性抗體來源的同種動物滅活的非免疫血清在特異性抗體之前進行處理，以封閉荷電點，不讓一抗結合，但這種方法一般實驗室很難實現，一般常見實用的血清是2%-10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室溫下作用10-30min即可，但應注意此種結合是不牢固結合，所以最好不要沖洗，傾去余液直接加一抗，對于多余的隆抗體來講，易產生背景著色，在稀釋特異性抗體時可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。

（3）緩沖液

免疫組化染色標記是對生物體組織抗原進行標記，抗原抗體最合適的pH值為7.2-7.6，最常用的是0.0l mol / LpH7.4磷酸緩沖液(PBS)。簡易配法：5000ml蒸餾水中分別加入l g NaH2PO4、15.6gNa2HPO4 、42.5gNaCl。但如果是采用堿性磷酸酶(AP)作為標記物底物的方法時可以用0.02mol/L TBS pH8.2緩沖液比較好。

（4）抗原修復

經甲醛固定的部分組織細胞，可使免疫組化標記敏感性明顯降低，這是因為甲醛固定過程中形成醛鍵或保存的甲醛會形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因此，在染色時，有些抗原需先進行修復或暴露。

抗原修復方法可分為化學方法和物理方法。化學方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制濃度不消化時間要適度。常用癿物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。

在選用這三種加熱法時，浸泡切片癿緩沖液的離子強度和PH值、加熱的溫度和時間均影響著抗原修復效果。目前最常用的修復方法有如下凡種：

1）胰蛋白酶(Trpsin)

主要用于細胞內抗原的修復。一般使用濃度為0.1%，37℃作用10min。配法：0.1g胰蛋白酶加入到0.1%pH7.8CaCl2(無水)水溶液中溶解后即可。

2）胃蛋白酶(Pepsin)主要用于細胞間質或基底膜抗原的修復。一般濃度為0.4%，37℃作用30min。配法：0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。

3）熱引導的抗原決定簇修復(Heat Induced Epitope Retrieval，HIER)

HIER對大多數的抗體有益，尤其是對核抗原的修復作用更加明顯，最常用的抗原修復液是pH6.0的檸檬酸緩沖液和pH8.0癿EDTA緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實現的。抗原修復液的pH值非常重要，有效的抗原修復pH值要比修復液的化學成分。

更重要，同樣的修復液隨著pH值的升高染色的強度逐漸增強，但最佳pH值范圍為6.0-10.0，對于大多數抗原這個范圍癿pH值都能進行有效的修復，有些抗體(如Ki-67、ER)則在pH值l.0-3.0和6.0-8.0更為有效。作為通用修復液堿性pH值的修復液要比酸性的有效，而對固定很長時間舊的存檔組織，酸性pH值的修復液則優亍堿性的修復液，所以兩種抗原修復液可作為相互替補的進行抗原修復。在進行HIER過程中應防止切片的干燥，加熱時必須達到預定的溫度，保溫時間要足夠，對于一些不要抗原修復的抗體最好不要采用HIER處理，否則對染色無益，但有些抗體則需要利用多種修復聯合應用。

HIER方法有：

1）水浴加熱法:將脫蠟人水后的切片放人盛有修復的容器中，放人加熱煮沸水中，當修復液溫度達到95℃左右時計時l5min，自然冷卻，PBS洗3min×3次。

2)微波加熱法:將切片放入修復液中微波加熱使溫度在96℃左右，計時l0min，在微波爐中停留2min，室溫自然冷卻，PBS洗3min×3次。

3)高壓加熱法:將修復液在高壓鍋中煮沸，切片插在染色架上，放入鍋中(要使修復液淹沒切片)開始噴氣時蓋上壓力閥。計時2min，況水沖至室溫取出切片，PBS洗3min×3次。

（5）顯色

免疫組化染色的顯色是最后的關鍵問題，一般辣根過氧化物酶(HRP)的檢測系統選用DAB或AEC顯色系統進行顯色。但要得到最佳的顯色效果，必須在鏡下嚴格控制，以檢出物達到最強顯色而背景無色為最終點，尤其DAB顯色時間短著色淺，時間長背景又深，都將影響結果判斷，根據經驗DAB在配制完后最長宜放置30min以內，過時不能使用，DAB加到組織切片時作用時間最長不宜超過10min(最好在5min內)，否則不管有無陽性都應終止反應。對一些含有內源性酶較高的組織用DAB顯色時極易出現背景色更應盡早在鏡下控制，以達到最佳的分辨效果（棕色）。AEC顯色系統（紅色）的弊端是易溶于有機溶劑，所以封片時應以水性封片劑為主，同時染色的切片也不能久存。如果是堿性磷酸酶(AP)最好選用NBT/BCIP作為顯色系統（結果染為藍黑色）。

（6）結果判斷

免疫組化的結果判斷有兩種方法：

一是對以檢測結果陽性細胞指數來定性(如核抗原的標記)，判斷方法是以一個規野中陽性細胞數不總細胞癿百分比，再取10個相同視野算取平均指數。

另一種方法以染色陽性強度和陽性檢出率相結合而定，一般陽性細胞數在0-25為陰性，25-50為十，50-75為十十，75以上為十十十。此種判定方法容易出現人為誤差現象。有條件的實驗室最好能用圖像分析系統進行結果檢測定量分析更為準確。一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結果判斷更標準，但各單位采取的標準不盡相同，所以判斷標準化問題還有待長期實踐中病理學術界商討判定標準。

IHC中常見的抗原表達模式有以下幾種：

1）細胞漿內彌漫性分布，多數胞漿型抗體的反應如此，如細胞角蛋白(cytokeratin，CK)和波形蛋白(vimentin)等；

2）細胞核周的胞漿內分布，其判別要點是細胞核的輪廓被勾畫得很清楚，如CD3多克隆抗體的染色；

3）胞漿內局限性點狀陽性，如CDl5抗體的染色；

4）細胞膜線性陽性，大多數淋巴細胞標記的染色如此，如CD20、CD45RO；

5）細胞核陽性，如Ki-67及雌、孕激素受體蛋白ER、PR等。一種抗體可同時出現。

 細胞漿和細胞膜的陽性表達，如EMA可呈膜性和胞漿內彌漫性陽性反應；CD30抗體可同時呈膜性和胞漿內點狀陽性反應等。

（7）對照片癿設置

免疫組化的質量取決于正確使用各種對照，沒有對照的免疫組化結果是毫無意義的。對照包括陰性對照、陽性對照和自身對照。在實踐中可用染色組織切片中不含抗原的組織作為陰性對照，而用含抗原的正常組織作陽性對照，這種自我對照具有節約的意義。觀察染色結果時，先觀察對照組織的結果，如陽性對照組織中陽性細胞呈強陽性，陰性對照細胞呈陰性，內源酶陰性，背景無非特異性染色時，表明本次實驗的全部試劑和全過程技術操作準確無誤，待檢組織中的陽性細胞也就是可信的正確結果。 免疫組化染色中對照片的設置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關鍵依據，而且也是檢測每一個抗體的質量標準，常設的對照如下，一般實驗最常用的只選第二種方法。

1）空白對照(陰性對照) 第一抗體由PBS或非免疫血清取代。

2）陽性對照 用已知含有要檢測抗原的切片作陽性對照。

3）回收實驗陰性對照 已知抗原不相應的第一抗體混合，發生結合沉淀，再用此沉淀抗體復合物進行免疫組化實驗，結果為陰性。

4）替代對照 用于第一抗體同種動物的血清或無關抗體代替第一抗體結果為陰性。

5）自身對照 在同一切片上，應將不同組織成分中的陽性戒陰性結果不檢測的目的物對照比較。如actin、CD34在正常組織中的血管壁肌層應為陽性，vimentin可以間質細胞，對照desmin以血管壁及肌束為對照，S-100蛋白以小神經末梢為對照等，如果應為陽性飛組織是陽性，則免疫組化技術正確，如為陰性，則表明染色技術有問題或免疫試劑質量有問題。

免疫組化染色

一．石蠟切片免疫組化染色實驗步驟：

1．石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應置60℃ 1小時）。

（1）二甲苯、II，各10分鐘。

（2）梯度酒精：100%，2分鐘® 95%，2分鐘® 80%，2分鐘® 70%，2分鐘。

（3）蒸餾水洗：5分鐘，2次（置于搖床）。

2．過氧化氫封閉內源性過氧化物酶：3%H2O2，室溫10分鐘（避光）。

3．蒸餾水洗：5分鐘，2次（置于搖床）。

4．抗原修復：根據待檢測的抗原，選擇適當的方法。

附：抗原修復液（10mM pH 6.0檸檬酸鈉緩沖液）的配制

（1）儲備液的配制：A液：檸檬酸三鈉-2H2O 29.41g + 蒸餾水1000ml  B液：檸檬酸21g + 蒸餾水1000ml

（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸餾水900ml

抗原修復的方法：

（1）高壓鍋處理技術：檸檬酸鈉緩沖液（10mM，PH6.0）,淹沒切片,蓋上鍋蓋，高壓鍋內煮沸,上汽3分鐘后緩慢冷卻（可用自來水在高壓鍋外沖，以助冷卻）。

（2）微波處理技術：用塑料切片架，置亍塑料或耐溫玻璃容器內，檸檬酸鈉緩沖液淹沒切片，選擇中高或高檔，5分鐘；叏出并補充已預熱的檸檬酸鈉緩沖液；再選擇中高戒高檔，5分鐘。（最佳溫度為92-95℃）

（3）酶消化處理：此略抗原修復的注意事項：

1）組織不能干。

2）選擇抗原修復方法要因抗體而異。

3）該方法主要用亍10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。

4）抗原修復后至DAB顯色的過程中，均需用PBS緩沖液。

5、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

6、正常血清封閉：從染片缸中出取切片，擦冷切片背面水分及切片正面組織

周圍的水分（保持組織呈濕潤狀態）,滴加正常山羊戒兔血清（不第二抗體同源動物血清）處理，37℃，15分鐘。

附：正常血清配制 (或按試劑盒規定的濃度配制)

按1:20比例,用PBS配制,每張切片需要量按50ml+5ml (10%拋灑量)計算。

7、滴加第一抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加第一抗體，37℃、2小時 。

（也可置于4℃冰箱過夜）。

8、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

9、滴加生物素化的二抗，37℃，40分鐘。

10、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

11、滴加三抗 （SAB復合物），37℃，40分鐘。

12、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

13、DAB顯色，鏡下觀察，適時終止（自來水沖終止）。

附：DAB的配制

（1）儲備液(DAB 25mg/ml)癿配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分裝成1ml,100ul,50ul，20ul等，—20℃，凍存。

（2）工作液：DAB儲備液20ul + PBS 1000ul + 3% H2O2 5ul

14．自來水（細水）充分沖洗。

15．蘇木素復染，室溫，30秒，自來水沖洗。

16．自來水沖洗返藍，15分鐘。

17．梯度酒精脫水：

80%，2分鐘 、95%，2分鐘 、100%，2次，5分鐘。

18．二甲苯透明：

I，II（二甲苯）各5分鐘。

19．封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。

二、細胞爬片的免疫疫組化染色： 1. 取出細胞爬片，迅速置入冷丙酮固定20-30分鐘。

2. 蒸餾水浸泡5分鐘，2次。

3. 打孔液浸泡5分鐘。

4. 蒸餾水浸泡5分鐘，2次。

5. 后接前述實驗步驟的第6步（正常血清封閉）。

注：第3、4步僅用于檢測細胞內抗原，檢測細胞膜抗原時不用。

三、冰凍切片的免疫組化染色：

1、新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機內切片(也可-80℃保存),厚度為5～6mm。

2、載玻片可不打底，裱片后，立即用電吹風吹干。

3、如不馬上染色，可密封后-20℃保存。

4、染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分鐘。

5、PBS洗2次,每次5分鐘,(必要時應用0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔)

6、3% H2O2滅活內源性過氧化物酶,20分鐘,避光；

7、用PBS洗2次,每次5分鐘；

8、接前面實驗步驟第六步。

四、載玻片的預處理：

1、洗衣粉液浸泡30分鐘，沖洗，晾干。

2、洗液 （含強酸、高錳酸鉀等）浸泡24小時，沖洗，晾干。

3、APES（1:50丙酮溶液）10-20秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。

4、純丙酮I，約10秒。純丙酮II，約5秒。

5、晾干或烤箱內烤干，備用。

 

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