一、概述

1 當前細胞培養和觀察的常用方法

十九世紀起，當顯微鏡出現后，人們就開始嘗試對細胞結構進行觀察，并在二十世紀發展出細胞的培養技術。單層細胞的培養相對方便，而且商業化的顯微鏡非常適合于平面的、薄樣品的觀察，所以，在二十世紀的中后期，人們普遍采用 2D 的細胞培養方法，進行生物學的研究，以及進行藥物的篩選、開發和疾病治療的研究。

2 2D 和 3D 細胞培養及對細胞的影響

通常，2D 細胞培養不但被用來在體外研究不同類型的細胞，還被用來進行藥物的篩選和評價等各個方面。這種單層的培養體系使細胞生長于聚酯或玻璃的表面，同時存在的培養液能夠給細胞生長提供養分。無數的生物學家通過這種方式極大地推動了生物學和醫學進展。

然而，其簡單的操作方法也造成了這種模式無法準確的描述和模擬細胞在體內復雜的微環境和各種復雜生物學過程，如細胞信號傳遞，生化過程或幾何學改變。另外通過 2D 細胞培養方法獲得的數據應用于體內也會造成一些誤導和不可預測性。這些原因促使很多科學家將目標轉向了 3D 細胞培養技術，一種在體外能夠更加準確描述細胞真實微環境的方法。細胞在體外三維環境下生長產生特殊的生物物理和生物力學信號，這些都會影響到細胞的功能，如細胞遷移、細胞粘附、增殖和基因表達等 ( 如下圖 )。

我們知道，有多種不同的 3D 細胞培養方法，不同的方法有著各自的優點和缺點。與 2D 培養不同，3D 細胞培養具有微小結構的形成和復雜的環境特征，能夠促進細胞的分化和組織形成。實際上，相比較于生長于 2D 環境，在 3D 環境中細胞能夠承受更多的形態學和生理學變化。有研究發現，細胞基底的成分和結構不但能夠影響基因表達，還能增強細胞間聯系。如有些促進細胞增值的基因在 3D 培養環境下受到抑制，從而不會像 2D 培養下那樣無限生長。3D 細胞培養還會促進共培養環境下的兩種不同細胞群體的生長，從而能夠準確重現組織功能。另外，3D 培養技術能夠使細胞微環境參數 ( 溫度、化合物濃度、氧氣、pH 等 ) 易于控制和監測。

但是 3D 細胞培養技術也有明顯的缺陷，這些缺陷還需要技術進步來彌補。首先，一些基質膠會從動物或其他來源吸收一些有害或不需要的物質，如病毒，可溶性因子等，會干擾細胞培養。有些基質具有很好的細胞粘附性，使細胞去除過程更加困難。 另外，3D 細胞培養技術是一種高性價比的技術，能夠在藥物評價階段省掉動物藥物測試過程，整個流程可實現自動化，可重復性好。

3 3D 細胞技術的延伸和前景

隨著 3D 細胞培養技術的發展和成熟，大量的新的相關技術出現，如微流控技術、微器官技術等。這些技術使得培養環境的控制和監測更加容易，同時能夠使藥物推進臨床的速度大大加快，評價結果的可靠性也會大大增加。

二、3D 細胞球培養方法

根據 3D 細胞培養中細胞生長情況，分為兩種方法，基于 Scaffold 基質膠的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 細胞培養法和無基質(SCAFFOLD-FREE) 的 3D 細胞培養。

1 基質的類型

基質是3D細胞培養的重要成分，根據不同的培養條件和目的，選擇不同的基質。

2 基于 Scaffold 基質膠的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 細胞培養法

基質為細胞培養中的細胞提供支撐。細胞能夠增殖并遷移進入基質網絡內部，最終粘附到基質上。當細胞生長時，成熟細胞相互影響，并最終形成接近于細胞來源組織的微型結構。在大部分情況下，這些細胞會表現為尺寸各異的球形，稱為細胞球：這些細胞結構通常用于藥物篩選、評價或者其他 3D 細胞的應用。通常，有基質支撐的 3D 細胞培養方法獲得的細胞球，由于基質提供了較大的接觸面積，其大小會比沒有基質支撐的方法獲得的細胞球更大。

2.1 基質的種類和成分

根據培養的細胞類型的不同，基質蛋白纖維的特性和形狀應與之相配合。基質蛋白纖維的布局應與模擬的器官結構相符，具有類似的結構、尺度和功能。然而，基質纖維越大、結構越復雜，就越難以提取。另外，為了防止任何可能出現的障礙 ( 免疫反應、纖維化、影響生長 )，無論采用何種類型的基質，所采用的基質都必須為細胞生長提供支撐，并具有生物相容性。基質可以是水凝膠，薄膜 ( 或者管狀 )，和 3D 基質結構。

2.2 水凝膠基質

凝膠具有很好的力學特征，是最常用的基質。它具有類似于組織的剛性，在某種程度上能夠很好地模擬細胞外基質的作用。事實上，就像其他的基質，凝膠這種空洞結構就像一個能夠保持營養物質和可溶性因子 ( 如細胞因子、生長因子 ) 的細胞外基質，這些可溶性因子由細胞產生，在凝膠種擴散，使細胞通過非直接接觸的方式進行通訊聯系。通過這種方法，非常適合于進行微型細胞實體組織的模擬，并在此基礎上進行藥物的毒性檢測和評價等。

包含大量水和天然生物分子 ( 藻酸鹽、明膠、透明質酸、瓊脂糖、層粘連蛋白、纖維蛋白 ) 都可作為基質。但是其凝膠化基質比較復雜，會使制備和操作非常困難。

合成的和天然的生物聚合物也可作為 3D 培養的凝膠。根據實驗條件和最終目的，可找到多種不同的聚合物，包括惰性的和可生物降解的。聚合物易于操作，更適合于構建基質。

其他類型基質：除了水凝膠外，還有很多基質材料可用。非凝膠聚合材料基質常用于組織工程，不同的材料都需要符合所要模擬器官的機械和物理學特征。

3 無基質 (SCAFFOLD-FREE) 的 3D 細胞培養

要形成細胞球，細胞團塊即可作為一種很好的生理模塊而無需依賴于固體物質的支持。這樣獲得的細胞球通常比較小，也相對松散。最主要的 scaffold-free 3D 細胞培養法就是 forced-floating ( 強制浮動法 ), hanging drop ( 懸滴法 ) 和 agitation based( 攪動法 )。

forced-floating ( 強制浮動法 ) 是用超低粘附的聚合物包被的多孔板來進行。通過向孔內加入細胞懸液后進行離心獲得。

懸滴法是通過將含有細胞的液滴處理，使細胞聚集為緊湊的均一的細胞球。

agitation based ( 攪動法 ) 使用生物反應器獲得三維的細胞球結構。

forced-floating ( 強制浮動法 ) 使用簡單，并且適合于批量獲得，應用廣泛。目前市場上有多種不同的產品能夠通過該方法，簡便快速地獲得 3D 細胞球。

3.1 均一化細胞球

均一化細胞球是采用如 Cell-able Oncology 多孔板獲得的細胞球。該板采用光刻技術，在多孔板表面光刻獲得一致大小的空洞，懸浮細胞可粘附于這些孔內生長成球。

這種方法獲得的細胞球大小尺寸均一，一致性好。同時，每個孔內有多個微孔，形成多個細胞球，能夠一次獲得大量細胞球的結果 ( 相當于重復 )，適合于大通量、規模化檢測。

3.2 超低粘附 U 型底多孔板

將細胞懸液加入到超低粘附的 U 型底多孔板內，經過靜置培養 2-4 天即可形成形狀大小規則均一的細胞球結構。

這種方法操作簡便，而且易于放大，耗材便宜，方便進行不同藥物的處理，非常適合于藥物的毒性評價和藥效篩選。

3.3 GravityTRAP 微球法

GravityTRAP 法是利用該耗材的特殊設計，其形式類似于多孔板，但是其底部是一個面積極其限制的一種耗材。該法類似于液滴法，能夠獲得形態均一的細胞球。但是只適用于部分類型的細胞 ( 見后表 )。

但是該法的操作不太方便 ( 手動加細胞懸液 )、耗材相對較貴，也一定程度限制了其在藥物篩選和評價中的作用。

3.4 GravityPlus

GravityPlus 是一種采用懸滴法獲得細胞球，將細胞懸液注入孔內，由于液體表面張力，會在孔下方形成倒垂液滴，液滴內細胞由于重力作用逐漸形成細胞球。

3.5 Hanging drop plate

采用響應的重力懸滴多孔板，采用常規的液滴法即可獲得均一的細胞球。

三、3D 細胞球的高內涵成像檢測技術

根據 3D 細胞球檢測的目的的不同，采用不同的成像方法，以此來高效便利地達到實驗目的。

1 透射光成像

采用高內涵進行 3D 細胞球的透射光成像是一種常用手段。通過透射光的成像，可以從整體上觀察細胞球的形態和大小，可以方便地進行細胞凋亡、生長抑制等方法的檢測。借助高內涵的圖像分析功能，能夠非常簡便地實現細胞球的識別、細胞球大小的測定以及細胞球細胞數量的評判。

2 熒光成像

2.1 寬場熒光成像技術

利用寬場熒光成像技術，能夠利用各種熒光試劑盒，實現細胞球內細胞凋亡的準確測量和評判，并能夠通過抗體標記技術準確測量細胞內的表達。對于寬場熒光成像，由于焦平面圖像受到非焦平面的熒光干擾，通常無法獲得準確的細胞數量 ( 僅能通過熒光陽性的面積大小進行近似計算 )。另外對于不同 Z 層面的細胞也缺乏分辨能力，造成結果有時有較大偏差。

可同時將寬場熒光成像技術和透射光成像技術結合，從而同時實現以上的功能。

2.2 共聚焦成像技術

采用具有共聚焦功能的高內涵系統，不但能夠獲得更清晰的細胞球圖像，同時還能夠獲得細胞球內部的圖像。通過共聚焦成像，能夠獲得細胞球內任意層面的圖像，可獲得非常準確的細胞定量信息，包括細胞數量、細胞凋亡、蛋白表達、蛋白分布等，而不像寬場熒光成像和透射光成像，僅能獲得細胞球整體信息。

3 3D 細胞球的分析技術

3.1 3D 細胞球分析的目的和意義

3D 細胞球技術是一種用于生物學研究、藥物篩選和藥物評價的非常有潛力的技術。由于其能夠通量化和規模化，除了新的相關技術用于腫瘤治療研究外，大部分用于藥物的篩選和評價。而對于藥物的篩選和評價，通過量化不同干預 / 藥物下的細胞球的變化 ( 形態學和功能 ) 都對于藥物研究有著重要意義，高準確度、無偏移地對細胞球和細胞球內的細胞進行定量就變得非常重要，這不但會影響藥物篩選的結果，對于區分不同 Hit 的藥效或作用，尤其是腫瘤個性化治療效果的體外準確評判，具有非常關鍵的作用。

3.2 2D 分析方法

3.2.1. 2D 分析方法的實現

細胞球作為一個三維結構，可通過其二維投影或二維結果來間接反映三維結構的特性。對于寬場熒光成像和明場成像，由于其 Z 軸分辨能力較弱，通常難以直接進行三維重構和分析，而主要進行二維方法進行分析。當然，目前有多種 3D 反卷積算法，如AutoQuant、Huygens 等提供的 3D 反卷積盲算法能夠大大提高寬場熒光的 Z 軸分辨率，其結果可以以三維的方法進行分析，參考后文。

要獲得二維投影圖像，需要對細胞球進行 Z 序列成像后，來獲得二維的最終投影圖像。

如上圖，先對細胞球的各個層面位置進行 Z 序列成像后，對獲得的Z序列圖像進行景深擴展或 Best Focus 處理后，能夠得到3D 細胞球的高質量 2D 投影圖像。其中 Z 序列圖像通常不采用最大投影 (Maximal Projection) 的方法，因為該方法會造成背景信號的累積，降低最終 2D 投影圖像的信噪比，并最終影響到分析結果。獲得的 2D 投影圖像，采用常規的 2D 分析方法，即可實現對于 3D 細胞球的定量分析。

對于共聚焦成像系統，由于系統本身就提供很高的 Z 軸分辨率，可通過對 Z 序列圖像的每一層圖像進行 2D 分析，對獲得的每一個 2D 結果平均化 / 或求和后，來反映 3D 結構的信息。

3.2.2. 2D 分析方法的缺陷

2D 是 3D 的投影或者子集。因此當通過共聚焦或 3D 反卷積獲得了 3D 細胞的 Z 序列圖像，獲得了細胞球的 3D 內部信息后，通過 2D 的方法進行分析獲得的結果只能從一個角度了解一個 3D 結構的信息，而無法獲得全貌。因為 2D 只是 3D 的一個子集，所以 2D 的結果會由于方法的不同，會產生較大偏差 ( 如下圖 )：

(1) 采用 2D 投影法會造成結果明顯偏低

右側為 3D 細胞球 Z 軸掃描其中的兩個層面。其中層面 3 和層面 5 在圖像相同的位置上 ( 紅圈 ) 均有細胞，即在同一個位置上的上面和下面均有細胞，這些細胞在獲得景深擴展圖像中就類似于同一個細胞，造成 2D 投影法分析獲得的細胞計數結果明顯偏低。

(2) 采用分層求和法會造成結果明顯偏高

右側為 3D 細胞球 Z 軸掃描其中的兩個層面。其中層面 8 和層面 9 均拍攝到了同一個的不同層面，造成分層求和法分析獲得的細胞計數結果明顯偏高。

(3) 當需要檢測不同細胞的距離和位置等空間信息時，兩種方法也會造成明顯的問題，如分層求和法無法進行位置和距離信息的測定； 2D 投影法由于獲得的只是一個平面的投影，其結果會明顯偏低或錯誤 ( 如細胞上下層疊時 )

3.3 3D 分析方法

當然，要想全面準確地獲得 3D 細胞球的信息只能通過 3D 分析方法。3D 分析方法能夠自動對 3D 細胞球進行三維空間重構，并在重構的三維空間進行細胞的定量測量 ( 細胞數量，大小，體積，表面積等 ) 和位置信息測量 ( 空間距離、位置等 )。

目前有一門新興的細胞應力學，通過對三維腫瘤細胞球、腫瘤組織中細胞的“擁堵特征”和“相變”( 通過三維結構內細胞之間接觸面積和空間細胞形態 ) 對腫瘤進行研究，并對腫瘤細胞的轉移基質研究取得相當進展。

四、ImageXpress Micro 家族產品進行 3D 細胞球培養和檢測的優勢

1 可用于所有 3D 細胞球方法

ImageXpress Micro 家族高內涵產品具有極強的兼容性和擴展性，能夠用于目前所有的 3D 細胞球的成像，并且同時支持新近出現的 3D 成像新方法，如 3D 細胞微流控、3D 微器官等實驗的快速成像和分析。優化完善超過 15 年的激光自動聚焦系統能夠快速找到 3D 細胞球的焦平面位置進行清晰成像。激光自動聚焦同時結合圖像自動聚焦技術，可以在不同孔內 3D 細胞球大小不同和懸浮高度不同的情況下也能準確快速找到 3D 細胞球的精確焦平面位置，實現快速準確的細胞球成像。

2 完善的激光自動聚焦 + 圖像自動聚焦，支持各種 3D 細胞球制作方法和未來新耗材的升級空間

IXM 系列高內涵系統完善且獨特的激光自動聚焦系統，能夠跟蹤樣品內的任意平面，達到快速精確的聚焦目的，能夠在 0.3 s內快速根據 3D 細胞球板材的設定準確定位細胞球。

以上為 Hanging drop plate 獲得的 3D 細胞球進行快速激光自動聚焦的示意，IXM 能夠自動獲得多個界面的反射光，并確定細胞球的位置。因為細胞球穩定懸浮于液面上面 ( 表面張力作用 )，通過確認細胞球的大概直徑，系統可通過細胞球液面界面為基準，快速準確地獲得細胞球 Z 軸精確位置。若通過圖像自動聚焦進行設定，系統找到細胞球 Z 軸精確位置后，能夠精確定位細胞球的任意層面。

3 高效靈活的 Z 序列采集，節省時間和空間

ImageXpress Micro 家族產品整合有高效方便的 3D 成像功能，能夠非常方便地進行細胞球的 3D 成像和 2D 成像。系統提供了自動化的 Best Focus 景深擴展功能，一次設置即可獲得，無需后續操作。靈活的功能允許單獨采集 3D Stack 圖像或 2D 景深擴展圖像，或者同時采集，方便客戶平衡 3D 的準確成像和 2D 景深擴展的需求。

4 轉盤共聚焦 + 3D 反卷積

ImageXpress Micro Confocal (IXM-C) 是一款高度靈活且具有高成像質量的共聚焦高內涵系統。其具有的多種共聚焦轉盤能夠實現高通量和高分辨率的成像。寬場或共聚焦成像的基礎上進行反卷積處理獲得更高分辨率和信噪比的圖像是生物學成像的常用方法。IXM-C 在轉盤共聚焦的基礎上同時具有 3D 反卷積功能，其獲得的轉盤共聚焦圖像本身具有極好的 Z 軸分辨率。通過結合 3D 反卷積功能，能夠進一步提高 XYZ 方向上的分辨率，能夠獲得更加清晰的圖像細節 ( 如上圖 )。

5 強大的 3D 分析功能

如前所述，3D 細胞球的圖像通過不同的 2D 識別分析可獲得一定的數據，但采用 2D 分析方法的缺陷十分明顯 ( 見前文 )。3D細胞球實驗準確的數據結果依賴于 3D 分析工具來實現。ImageXpress Micro 高內涵系統具有高性能的 3D 分析工具。可以實現軟件自動在三維層面識別細胞，并自動進行三維結構重構，并在重構的三維結構中進行細胞的識別和分析。

6 并行分析計算

ImageXpress PowerCore 是用于 MD 高內涵系統的并行分析計算功能，能夠實現以下有用功能：

A：圖像采集過程中同步進行圖像分析 ( 不會影響圖像采集速度 )。

B：大大加速圖像分析所用時間。

當進行 3D 成像和分析時，由于需要進行不同層面的多個 Z 軸圖像來進行 3D 信息的準確獲取，獲得的圖像數量和分析負荷會明顯增大。采用 ImageXpress PowerCore 能夠明顯提升圖像分析的速度，大幅度提升通量，并能夠提供比圖像采集速度更快的分析速度。以下例子能夠直觀地反映出 ImageXpress PowerCore 的強大功能。

7 3D 細胞球 + 細胞功能檢測

常規體細胞的細胞系或者腫瘤細胞系是做 3D 細胞球實驗的常規對象細胞。對于某些特殊細胞，如神經細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、內分泌細胞，其正常生理特性依賴于其特定的細胞特性，如動作電位、局部電位變化、離子釋放等。MD 高內涵系統不但能夠進行 3D 等復雜實驗的成像分析，包括以上特殊細胞類型的諸如動作電位變化頻率、速度等能夠進行快速成像和特性分析。

iCell 分化獲得的神經細胞，在小型凝膠培養基內生長成為神經網絡。通過鈣離子試劑的標記，可以看到神經細胞上由于動作電位引起的鈣離子釋放，說明神經網絡功能良好。軟件系統能夠自動識別熒光標記的細胞，并自動分析電信號 ( 鈣離子釋放 ) 的變化頻率和幅度。

五、總結

3D 細胞球檢測技術會帶來較傳統 2D 細胞檢測方法更加準確可靠，且更加接近于臨床實驗的結果。準確的結果在藥物篩選上能夠大大降低藥物篩選的成本和時間，而在科研上，由于其先天的優勢，能夠更加真實地反映出細胞的生物學表現和反應。3D 細胞球技術是一種基礎方法，隨著技術的發展，出現了更多特異化的方法，如類器官，微組織等方法，為生物學研究和藥物篩選提供了更加有力的武器。

3D 細胞球技術，由于其本質為三維結構，因此，只有通過三維成像和分析技術才能獲得準確可靠的結果。Molecular Devices 公司的 ImageXpress Micro 系列高內涵系統，不但提供了 3D 細胞球技術實現的所有細節和功能，包括3D 成像及 3D 分析，其對于目前市場上 3D 細胞球技術的耗材實現了全兼容。其完善的激光自動聚焦+圖像自動聚焦技術有極大的容忍性和開放性，能夠實現未來新型耗材和方法的檢測和分析。MetaXpress PowerCore 高內涵并行加速軟件系統能夠大大提高系統分析通量，加速藥物檢測和時間和人力成本。