前言

球體是小型的3D細胞培養微環境，可以用于諸如低吸附微孔板等特殊的方法進行細胞培養。這種體外3D細胞培養模型具有高度的臨床及生物可靠性，并且已經被廣泛應用于高通量篩選(HTS)和高級細胞培養，從而方便對諸如化合物毒性和癌癥等重大疾病進行研究。Multicellular tumor spheroids(MCTS)可以模擬腫瘤組織，因此其經常被用來彌補傳統2D環境，如在微板上的單層細胞和動物模型間的缺失。目前3D技術已經被廣泛地接受作為更精確的模擬癌癥細胞在體內的生物學狀態和有效評估新的抗癌策略的方法。

FUCCI(fluorescent ubiquitination-basedcell-cycle indicator)小球能鑒別細胞處在細胞周期的哪一時期，因此可以用來研究癌癥細胞周期的進程。FUCCI技術建立在鑒定過表達的兩種調節細胞周期的蛋白geminin和Cdt1水平上，其中geminin融合的是綠色熒光基團AmCyan，而Cdt1融合的是紅色熒光基團mCherry。Cdt1和geminin的水平隨著細胞周期的變化而不斷波動：Cdt1蛋白水平在G1階段達到峰值，而geminin蛋白水平在S，G2和M期不斷升高。這一結果體現為表達FUCCI細胞核在G1期為紅色而在S，G2和M期則呈現綠色(圖1)。

SpectraMax^®i3x多功能讀板機配置SpectraMax^®MiniMax^TM300細胞計數儀，具有transmittedlight(TL)，綠色(Ex/Em:460/541)和紅色(Ex/Em:625/713)熒光通道。MiniMax細胞計數儀的SoftMax^®Pro軟件可以用來獲得各種細胞的圖像并進行分析。本說明旨在介紹如何利用MiniMax細胞計數儀快速高效地獲取及分析FUCCI小球的圖像。

優勢

- 應用細胞成像功能實時監測細胞周期進程
- 多參數分析細胞球，操作簡便
- SoftMax Pro 軟件可以靈活地自定義細胞球的分析方法，滿足不同的實驗要求

材料

- SpectraMax i3x 多功能讀板機 (Molecular Devices cat. #i3x)
- SpectraMax MiniMax 300 細胞成像儀(Molecular Devices cat. #5024062)
- Corning 96-well 低吸附 U 底板 (Corning cat. #7007)
- A375S FUCCI 細胞 (Institute of CancerResearch 提供, London)
- DMEM / F12 培養基 (Invitrogen cat.#11320-033)
- EGF (Invitrogen cat. #PHG0311)
- B27 補充液 (Invitrogen cat #17504001)

方法

球體的制作和培養

Institute of CancerResearch(ICR)負責制造表達FUCCI報告系統mCherry-Cdt1和AmCyan-geminin的細胞，制作按照Dufau等人發表的流程進行。A375S FUCCI球體準備的方法如下：Corning公司96孔U型底低吸附細胞培養板中加入含有EGF(20ng/mL)和B27(1x)的DMEM/F12培養基，按每孔1,000細胞進行種板。細胞板離心(800g，6min)后在37℃，5%CO₂條件下進行孵育。最后，用含10%FCS的培養基清洗球體3次以移除EGF和B27，繼續培養1至6天。

數據分析

MiniMax細胞計數儀的透射光模塊可以從自動聚焦得到最佳的圖像效果。SoftMax Pro軟件中的“Field Analysis”能進行自定義分析從而鑒別細胞重疊的部分。我們應用一種特殊的鑒別方法來區分目標球體和其余物體，如殘渣和個體細胞，從而在后續的分析中予以去除(Figure2,AandE)。最后，我們選擇感興趣的區域并從圖像中去除不想要的物體。在綠色和紅色熒光通道中，球體可以通過“Object Count”模式中大小和與背景相對熒光強度的區別被輕易的篩選出來(Figure2,B-D,F-G)。然后運用SoftMax Pro軟件計算圖像的“%Area coverage”和球體的“Object Area”(μm2)。圖像的獲取和分析的設置方法見表1。

結果

SoftMax Pro軟件中獲取及分析的設置可以在綠色和紅色熒光通道的透射光下簡便快速的分辨每個孔中的單球體。SoftMax Pro軟件還可計算所有通道包含的面積占比和物體面積(μm2)(圖2，表2)。在綠色和紅色熒光通道下可以獲得最好的結果。

對于FUCCI球體來說，圖2中紅色部分展示的是光滑圓潤的球體而綠色部分則在細胞表面，說明球體內部的細胞處在G1期而表面細胞即將進入M期。

對應軟件可以分辨球體大小和形狀(球形參數)的各種變化，因此常用來研究多種處理，如抗癌藥物，對細胞增殖的影響(圖3)。MiniMax中綠色和紅色熒光的光學成形功能可以將3D圖像轉換為2D投射球體圖。

結論

MiniMax細胞計數儀配合SoftMax Pro軟件的整合數據分析可以獲取綠色和紅色熒光通道及透射光下FUCCI球體的圖像并進行分析。實驗者可以用多種方法對球體進行評估，包括圖像覆蓋的區域，目標物大小、形狀，從而為實驗者提供了多參數全景的細胞數據分析。SpectraMax i3x多功能讀板機搭配MiniMax細胞計數儀完美的將成像的優勢和讀板機的簡便結合在一起。通過簡化的數據采集和分析流程，SoftMax Pro軟件提供了FUCCI球體分析的完整解決方法。

文獻

1. Dufau I, Frongia C, Sicard F, Dedieu L,Cordelier P, Ausseil F, Ducommun B,Valette A: Multicellular Tumor Spheroid model to evaluate spatio-temporaldynamics effect of chemotherapeutics.Application to the gemcitabine / CHK1nhibitor combination in pancreaticcancer. BMC Cancer. 2012, 12 (1):15-10.1186/1471-2407-12-15.
2. Jennifer Laurent, Céline Frongia,Martine Cazales, Odile Mondesert,Bernard Ducommun, Valérie Lobjois:Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.BMC Cancer. 2013, 13:73, 10.1186/1471-2407-13-73.
3. http://www.di.uq.edu.au/sparq/Dynamic%20tumour%20heterogeneity%20in%20melanoma%20therapy%20resources/Spoerri%20et%20al%20MMB%20accepted.pdf
4. https://www.westburg.eu/products/protein-analysis/fluorescent-proteins/-cell-cycle-fluorescent-reporter-vectors-fucci/$16360