動物骨髓中性粒細胞分離液試劑盒使用說明
各種動物骨髓中性粒細胞分離液試劑盒
規格：200 mL/kit
保存：本產品對光敏感，應該室溫避光儲存，保質期 2 年。無菌開封后，保存于室溫。
試劑盒組成：
試劑A 200mL
試劑C 100mL
細胞洗滌液 200mL
全血及組織稀釋液 200mL
紅細胞裂解液 100mL
操作步驟：
- 制備骨髓的單細胞懸液。
- 細胞懸液體積小于5mL時，在離心管中先加入4mL試劑A，后將2mL試劑C小心疊加于試劑A之上，形成梯度界面（細胞懸液體積大于等于5mL，試劑A與試劑C比例2：1，試劑總量與稀釋后的樣本量相等。但二者的總體積不能超過離心管的三分之二，否則會影響分離效果），將細胞懸液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴
氏德吸管吸取細胞懸液，然后將細胞懸液小心的平鋪于分離液上，因為兩者的密度差異，將形成明顯的分層界面。如果樣品較多，加樣的時間較長，在離心之前出現紅細胞成團下沉屬正�，F象。）
3. 室溫，水平轉子500~1000g，離心20~30min（細胞懸液的體積越大所需的離心力越大，離心時間越長，最佳的分離條件
需摸索，離心轉速最大不超過1200g）。
- 離心后，離心管中將出現兩層環狀乳白色細胞層，上層細胞為單個核細胞層，下層細胞為中性粒細胞層，如圖所示（個體差異或者是分離條件不同，粒細胞層可分離不明顯）。
- 用吸管小心吸取試劑C與試劑A之間以及試劑A中的中性粒細胞到15mL潔凈的離心管中，10mL PBS或細胞洗滌液洗滌細胞。250g，離心10min（如有紅細胞混雜則加入適量紅細胞裂解液）。
- 棄上清，5mL的PBS或細胞清洗液重懸細胞，250g，離心
10min。
- 重復步驟6
- 棄上清，細胞重懸備用。
骨髓單細胞懸液的制備方法
小動物骨髓的采集：
稀釋液
單個核細胞層試劑C
中性粒細胞層試劑A
紅細胞層
1. 處死動物，無菌提取股骨和脛骨，剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔（注意盡可能少的剪走骨髓腔）。
2. 取1ml的無菌注射器，吸取少量的含有10%標準胎牛血清的稀釋液或者是含有血清的培養基，沖洗骨髓腔以獲得骨髓。
3. 最終制備成2×108–1×109/ml 的單細胞懸液備用。大動物骨髓的采集：
大動物骨髓的采集可采取活體穿刺方法：先將動物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮膚，然后估計好皮膚到骨髓的距離，把骨髓穿刺針的長度固定好。操作人員用左手把穿刺點周圍的皮膚繃緊，右手將穿刺針在穿刺點垂直刺入，輕輕左右旋轉將穿刺針鉆入，當穿刺針進入骨髓腔時常有落空感。連接注射器緩慢抽吸骨髓組織，當注射器內抽到少許骨髓時即停止抽吸。用含10%標準胎牛血清的稀釋液調整細胞濃度為2×108–1×109/ml 的單細胞懸液備用。
常用的骨髓穿刺點：
股骨：穿刺部位在股骨內側面,靠下端的凹面處； 胸骨：穿刺部位是胸骨體與胸骨柄連接處；
肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各點的中點；
脛骨：穿刺部位是股骨內側、靠下端的凹面處。如果穿刺采用的是肋骨，穿刺結束后要用膠布封貼穿刺孔，防止發生氣胸。
注意事項：
A. 開封前顛倒混勻，本分離液為無菌產品，為延長分離液保存時間，請在無菌條件下啟封，避免微生物污染。。B. 分離液使用時應始終保持室溫（18℃~25℃），如室內溫度較低，可將分離液預熱。4℃或者是溫度較低的條件下離心，可能會導致白膜層中紅細胞污染加重。
C. 洗滌細胞，不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養液，其成分會導致血細胞凝集，大大降低細胞得率及純度。D. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會導致細胞掛壁，影響分離效果。
E. 如果要進一步對分離的細胞進行培養，那在收集血液和分離過程中，注意無菌操作，避免微生物污染。
F. 不同動物血液在不同比重分離液中的細胞離散系數及細胞帶電不同，用戶在制定分離液時應提供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細胞的名稱。
