一、背景：

Sapidyne Instruments Inc.于1995年在美國創立，產品基于獨特的Kinetic Exclusion Assay（KinExA^®）專利技術。在公司成立早期，Xavier大學、美國陸軍和環境保護局等研究單位采用KinExA技術開展了大量工作；經過數十年在生物制藥領域、科研領域及環境監測領域的廣泛應用，KinExA技術已成為頂級制藥公司和生物技術公司以及許多大學、獨立研究實驗室和環境監測機構研究相互作用和生物活性物質檢測的必備工具，并且得到FDA和EMA認可。

二、KinExA的價值：

   新藥研發成本動輒數十上百億美元，靈敏可靠的儀器在研發早期即可協助準確甄選苗頭候選藥物（hit），減少不必要的支出，降低研發風險。由于KinExA可在生理條件下獲取準確可靠的結合常數，具有很高生物相關性，而且成本極低，目前被很多頂級制藥公司用作主要的驗證工具。

三、KinExA  vs.  SPR：

1、與SPR的區別：SPR在芯片表面固定一個分子，通過芯片表明與溶液間二維相互作用的物質量改變而實現SPR檢測。這就帶來了非常顯著的缺點：固定在芯片上的生物分子可能不能維持其天然活性、質量遷移影響動力學分析（例如，流速會影響實驗結果）、被檢測分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物結構其分子量有上限限制、樣品需要純化及無法檢測完整細胞。

相反，KinExA分析三維水平及游離狀態相互作用，不固定任何分子、不會對平衡帶來影響、沒有質量遷移的限制、可以檢測未純化樣品和完整細胞；因此，極寬范圍內的生物分子、生物結構及完整細胞均可靈活分析

2、與SPR技術的對比：為了表征治療性單克隆抗體候選分子，研究者采用不同類型芯片，從Biacore系統獲得同一組單抗-抗原的53組數據，與KinExA實驗數據對比發現，親和力及動力學數據與所使用的芯片類型有關，帶負電荷的CM5,CM4及CM1芯片對Biacore的動力學數據有不利的影響。為了驗證這一假設，作者通過Biacore液相實驗，KinExA平衡態滴定以及KinExA動力學實驗，精確計算抗體與抗原的親和力及動力學參數。結果表明隨著芯片表面負電荷的降低，親和力及動力學參數與液相實驗所得的結果越接近。可能的原因：（1）帶負電荷的葡聚糖芯片與抗體之間的空間位阻影響抗原的結合；（2）帶負電荷的抗原與芯片表面的負電荷靜電排斥。

表中結果表明：對于Biacore技術，不同的固定方式（氨基偶聯，捕獲）以及不同的芯片，對實驗結果均有明顯影響。而采用KinExA技術，溶液中加葡聚糖，對結果也無明顯影響。

圖A,圖B均采用KinExA技術檢測。圖A中buffer不含葡聚糖，K_D=24.7pM；圖B中buffer加入葡聚糖，K_D=33.2pM。

圖C，圖D均采用Biacore技術檢測。圖C采用氨基偶聯的方式CM5芯片固定抗體，K_D=2.05nM；圖D采用捕獲的方式CM5芯片固定抗體，K_D=2.86nM

四、案例

    案例一：完整細胞的相互作用檢測

<背景>：單克隆抗體XMetA是胰島素受體（IR）變構部分的激動劑，其激活代謝Akt激酶信號通路，而對有絲分裂胞外信號調節激酶（ERK）信號通路幾乎沒有影響。為了研究這種選擇性信號通路的性質，作者驗證了XMetA對CHO細胞中IR，Akt和ERK的特異性磷酸化和活化的影響。

<目的>：完整細胞親和力檢測。

<方法>：研究者將表達短鏈型（IR-A）及長鏈型（IR-B）胰島素受體的不同濃度CHO細胞分別與XMetA孵育，通過離心獲得游離的XMetA，用KinExA儀器檢測親和力。另外，作者采取同樣的策略，用KinExA儀器檢測胰島素與CHO細胞表面IR-A，IR-B的親和力。

<結論>：XMetA與IR-A亞型的親和力為55±16pM，與IR-B亞型的親和力為50±11pM。另外，在對照抗體組，胰島素與IR-A亞型的親和力為156±14pM；在XMetA組，胰島素與IR-A亞型的親和力為216±100pM；在對照抗體組，胰島素與IR-B亞型的親和力為221±28pM；在XMetA組，胰島素與IR-B亞型的親和力為277±112pM。數據同時說明， XMetA與IR亞型的結合與胰島素無關。

     案例二：細胞與上清未純化樣品檢測

<背景>：單克隆抗體（mAb）在體內與膜蛋白間親和力的可靠評估是腫瘤治療的主要問題。在BV展示系統中，膜蛋白能以天然狀態在病毒表面展示。

<目的>：細胞與上清中未純化樣品親和力檢測。

<方法>：研究者基于KinExA技術，結合桿狀病毒（BV）膜蛋白展示系統，描述了一個簡單而高度敏感的單克隆抗體評估方法。

<結論>：在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上（BV beads）,其KD值(~10pM)與全細胞分析方法一致（R²=0.998），表明基于KinExA技術檢測方法提供了針對細胞表面蛋白的單克隆抗體親和力準確的評估。

上圖中顯示的是KinExA實驗中所使用的抗原。A圖中可溶性Robo1用于標準的實驗分析；B圖中表達天然活性Robo1的CHO細胞用4%多聚甲醛固定，用于細胞分析實驗；C圖中表達天然活性Robo1的BV磁珠用于BV展示分析

下圖采用KinExA技術檢測抗Robo1抗體與抗原的親和力。曲線上方的數字代表抗體的活性濃度。

KinExA參考文獻

  Danial M, et al. 2017.Site-Specific Polymer Attachment to HR2 Peptide Fusion Inhibitors against HIV-1 Decreases Binding Association Rates and Dissociation Rates Rather Than Binding Affinity. Bioconjug Chem. 10.1021/acs.bioconjchem.6b00540.

  Fleming JK, Wojciak JM. 2017. Measuring Sphingosine-1-Phosphate: Protein Interactions with the Kinetic Exclusion Assay. Methods Mol Biol. 10.1007/7651_2017_5.

  Bedinger, D., et al. 2015. Differential pathway coupling of activated insulin receptor drives signaling selectivity by XmetA, an allosteric partial agonist antibody. J Pharmacol Exp Ther 353(1):35-43.

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