簡介
細胞活 / 死測定被廣泛應用于各種研究領域，包括各種化合物的細胞毒性作用、實驗處理或基因表達變化的研究。自動細胞成像和分析系統提供了一種評價細胞活性和細胞死亡的最佳方法。在本篇應用文獻中，我們介紹了使用 ImageXpress®Pico 自動細胞成像系統以及 CellReporterXpress 自動圖像采集和分析軟件對 EarlyToxTM Live/Dead 檢測試劑處理的細胞進行成像。EarlyTox Live/Dead 檢測試劑盒包含了針對哺乳動物活細胞和死細胞的標記物。活細胞可被在細胞質中能夠發出強烈綠色熒光的Calcein AM 染色。不發熒光的 Calcein AM 可穿透完整細胞膜且其乙酰羥甲基酯 (AM) 基團可被細胞內的脂酶裂解，得到可發出熒光的鈣黃綠素分子。死細胞標記物乙啶二聚體-III(EthD-III) 對完整細胞質膜而言既無熒光也無穿透能力。當與死亡細胞相關的細胞膜完整性受到損傷時，EthD-III 進入細胞并與細胞核結合，在細胞中產生明亮的紅色熒光。影響細胞膜完整性的細胞毒性事件可以使用這種方法準確的評估。該檢測試劑盒可對測試化合物的全濃度響應特性進行表征。這種免洗、均相實驗可減少因為洗滌步驟導致的死細胞被沖洗掉的情況。使用 ImageXpress Pico 系統和 CellReporterXpress軟件能準確檢測到來自鈣黃綠素和 EthD-III 的熒光信號并獲得高質量的圖像及分析結果。

方法

HeLa 細胞以 5,000 細胞 / 孔接種于黑色 384孔底透微孔板中，37°C, 5% CO2 孵育箱內生長過夜。用十字孢堿 (staurosporine )( 通用蛋白激酶抑制劑和潛在的抗癌治療藥物 ) 或絲裂霉素 C ( 強效DNA交聯劑與化療藥物 ) 處理細胞 24 小時，做 4 個平行，按1:3 梯度稀釋，起始最高濃度為 10 μM 十字孢堿和 300 μM 絲裂霉素 C。化合物處理完成后，用 Live/Dead 檢測試劑結合 Hoechst33342 核染料 (Thermo Fisher)對細胞進行染色。每孔移去一半體積液體并替換成 2x Calcein AM 和EthD-III 染色液。染色液濃度為 2 μM Calcein AM 和3 μM EthD-III。在添加 Hoechst ( 6 μM 終濃度 ) 前，孔板在 37°C, 5% CO2 下孵育30 分鐘。細胞再次以 37°C, 5% CO2 孵育15 分鐘。最后一次孵育結束后立即將孔板在 ImageXpress Pico 系統上用 10xPlan Fluor 物鏡進行成像，熒光通道分別為針對 Calcein AM 的 FITC 通道、針對 EthD-III的 Texas Red 通道和針對 Hoechst 染料的 DAPI 通道。在此放大倍數下，一張單獨的圖像一個視野下可以采集多達4000-4500 個細胞，足以獲得統計學相關結果。